[发明专利]一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法

说明书

本发明属于食品加工技术领域，提供了一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法。步骤如下：提取菌株Alteromonas sp.162基因组；扩增获得普鲁兰酶基因并构建重组质粒，以重组质粒为模板，扩增获得普鲁兰酶点变体基因h611Q并构建点突变重组质粒，以点突变体重组质粒为模板，扩增普鲁兰酶叠加突变体基因puld5/h611Q，构建叠加突变体重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，制备并纯化叠加突变体Puld5/H611Q。其优点：Puld5/H611Q比活力最高达145.2U·mg^‑1，比鲁兰酶提高2.5倍；Puld5/H611Q最适pH为6.0，最适反应温度为50℃，比普鲁兰酶提高15℃，半衰期为普鲁兰酶的5倍；Puld5/H611Q催化效率约为普鲁兰酶的1.2倍。将截断突变和点突变相结合，制备方法简单，获得的Puld5/H611Q性能优于现有普鲁兰酶，可提高淀粉利用率。

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，尤其是涉及一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法。

背景技术

在淀粉加工工业中，很多淀粉原料中存在支链淀粉，如玉米、马铃薯、小麦等中的支链淀粉约占70％以上，稻谷中支链淀粉约占80％，蜡质玉米与糯米中支链淀粉接近100％。这些支链淀粉的存在造成了淀粉利用率降低和产品质量下降。普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶，可以专一性切开支链淀粉分支中的α-1,6糖苷键，形成直链淀粉。利用普鲁兰酶来消除支链，可以提高淀粉利用率、降低粮耗。随着我国淀粉加工行业的快速发展，企业对普鲁兰酶需求激增，对普鲁兰酶生产菌株开发也逐渐升温。目前我国所使用的普鲁兰酶几乎全部依赖于国外进口，价格昂贵，生产成本高。虽然我国市场上已出现少量国产普鲁兰酶商品，但是短时间内还难以打破国外公司对该产品的垄断局面，严重限制了我国淀粉加工相关工业的快速发展。

目前，获得高活性普鲁兰酶主要包括3个途径：1)筛选高活性普鲁兰酶的野生菌，并进行发酵培养条件优化，但普鲁兰酶基因转录与翻译受细胞自身调节与控制，导致普鲁兰酶的产量较低、稳定性差、不易控制。2)通过重组技术，采用大肠杆菌或者枯草杆菌表达重组普鲁兰酶，大大提高其活力；但重组普鲁兰酶分泌效率仍然非常低，细胞破碎会增加生产成本。3)通过截短部分结构域，提高普鲁兰酶胞外分泌效率，但同时也会降低其活性。因此，获得高活性，高效分泌能力的普鲁兰酶，仍是该领域发展的制约瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，由此方法制造的普鲁兰酶，其作为食品加工工业中的酶制剂，提高了淀粉利用率、降低粮耗，弥补现有普鲁兰酶的不足。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)菌株Alteromonas sp.162的发酵

将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种于液体培养基中，所述液体培养基组成为普鲁兰多糖5-10g，蛋白胨0-1g，酵母粉0.1-0.25g，陈海水1000mL，pH值7.0-7.2；培养基于100-120℃灭菌30-50min；冷却后，将试管斜面保存的菌株Alteromonas sp.162接种到500mL的三角瓶中，其中含300mL培养基，于10-15℃，200-250rpm下振荡培养24-48h后，得发酵液；

(2)菌株Alteromonas sp.162的普鲁兰酶编码基因pulA的克隆