[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其应用和利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法

权利要求书

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，能够表达来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillusalcalophilus DTY1的EctA、EctB和EctC。

2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述EctA、EctB和EctC的编码基因为四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码基因，由启动子+EctA编码基因+间隔序列+EctB编码基因+间隔序列+EctC编码序列+终止子组成。

3.根据权利要求2所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子为P43启动子、pHY300PLK载体上的启动子或来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilus DTY1的天然启动子。

4.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌无法表达四氢嘧啶跨膜转运蛋白OpuC。

5.根据权利要求1或4所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌无法表达中性蛋白酶nprE、碱性蛋白酶aprE、淀粉酶amyE和芽孢形成转录因子spo0A。

6.根据权利要求4或5所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述无法表达通过敲除蛋白编码基因或通过GRISPR的方法在蛋白编码基因中引入终止密码子破坏其表达。

7.权利要求1-6任意一项所述重组枯草芽孢杆菌在生产四氢嘧啶中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述生产四氢嘧啶的原料为酶法合成谷胱甘肽的废水。

9.一种利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，包括：

步骤1、提供酶法合成谷胱甘肽的废水；

步骤2、将权利要求1-6任意一项所述重组枯草芽孢杆菌接入所述废水中发酵，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液，离心或板框压滤发酵液获取湿菌体；

步骤3、所述湿菌体破壁后经膜过滤，滤液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；或

所述湿菌体用水搅拌洗涤，离心后上清液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；或

所述湿菌体用乙醇浸提，浸提液回收乙醇后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；

步骤4、洗脱后的四氢嘧啶经过精制得到四氢嘧啶成品。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述酶法合成谷胱甘肽的废水为利用微生物发酵生产谷胱甘肽合成酶的酶液，催化谷胱甘肽合成原料合成谷胱甘肽工艺中产生的废水，包括谷胱甘肽合成酶的发酵废水和谷胱甘肽合成酶反应纯化废水。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶的发酵废水经由以下方法获得：

能够表达谷胱甘肽合成酶的转基因微生物菌株发酵后的发酵液离心分离得菌体液和上清液；菌体液匀质破菌、膜过滤得菌体碎片；上清液和菌体碎片液合并作为谷胱甘肽合成酶的发酵废水。

12.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶反应纯化废水经由以下方法获得：

谷胱甘肽合成原料加入谷胱甘肽合成酶的酶液进行反应，反应完成后得到谷胱甘肽粗品溶液，依次经过膜分离、离子交换柱层析、结晶工艺进行纯化获得谷胱甘肽纯品，被膜分离和离子交换柱层析截留的废液作为谷胱甘肽合成酶反应纯化废水。