[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其应用和利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法

说明书

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其应用和利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法。本发明通过基因工程技术构建一株重组枯草芽孢杆菌，其能够利用酶法合成谷胱甘肽的废水进行发酵，并得到含四氢嘧啶的发酵液。经提取不仅可获得较多的四氢嘧啶，同时得到副产物菌渣蛋白饲料，而且排放的废水比原废水中COD、BOD、总磷、氨氮等下降71～97％，该方法还具有操作简便，节省资源，安全环保，成本低等优点，适合工业推广应用。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其应用和利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoine)是许多耐盐和嗜盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜和核酸等提供保护作用。此外，四氢嘧啶对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，四氢嘧啶在精细化工和生物医药等行业将具有广泛的应用前景。

目前，四氢嘧啶的生产方法主要通过嗜盐微生物(特别是盐单胞菌)的高密度发酵来获得。也有专利报导了转基因大肠杆菌工程菌(CN105018403A、CN106754603B、CN112280726A等)和转基因谷氨酸棒杆菌工程菌(CN107142234B、CN 110699310 A等)发酵产生四氢嘧啶，还有采用克劳氏芽孢杆菌、盐单胞菌发酵产生四氢嘧啶的。

目前现有的生产菌株及使用其生产四氢嘧啶的方法，均需要高的NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物，发酵周期较长，而且高浓度的氯化钠溶液对发酵设备腐蚀严重，不适合大规模的工业化生产，同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力；酶催化法生产四氢嘧啶的底物为天冬氨酸钠，酶需要诱导表达并提取，因此操作比较复杂，生产成本较高。严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。

目前发酵法或酶催化法生产谷胱甘肽的高磷高盐废水很难处理，使谷胱甘肽生产成本较高。枯草芽孢杆菌不受发酵法或酶催化法谷胱甘肽废水成分抑制，经诱变或基因重组可在低到中盐度的协迫下产生四氢嘧啶，使四氢嘧啶生产成本大大降低，同时也解决了谷胱甘肽的高磷高盐废水难处理问题。目前的枯草芽孢杆菌多用于α淀粉酶和中性蛋白酶工业生产，尚未发现将其用于工业生产四氢嘧啶的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌，使其能够利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶；

本发明的另外一个目的在于提供上述重组枯草芽孢杆菌在生产四氢嘧啶中的应用以及一种生产四氢嘧啶的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组枯草芽孢杆菌，能够表达来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilusDTY1的EctA、EctB和EctC。其中，EctA的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，EctB的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，EctC的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。

表达上述三个蛋白的编码基因可以是三个蛋白分别以独立的基因元件：启动子+EctA/B/C编码基因+终止子重组至枯草芽孢杆菌中进行表达，也可以以四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码基因方式一起表达，基因元件由启动子+EctA编码基因+间隔序列+EctB编码基因+间隔序列+EctC编码序列+终止子组成。作为优选，所述启动子为来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilus DTY1的天然启动子(如SEQ ID NO.4所示1-812bp序列)、P43启动子或pHY300PLK载体上的启动子。