[发明专利]一种热稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其应用。本发明通过半理性设计和定点突变技术改造甲酸脱氢酶分子结构，最终获得了热稳定性提高的突变体酶K21P/K22R。突变体酶K21P/K22R在65℃孵育60min后，仍可保留高于80％的酶活，而亲本在65℃孵育30min后完全失活。突变体酶K21P/K22R的Tsubgt;m/subgt;为68.8℃，比亲本提高了4.5℃。同时，突变体酶K21P/K22R对底物甲酸钠的亲和力比亲本提升了近一倍，对甲酸钠的催化效率提升了40％；突变体酶K21P/K22R与亲本相比具有更广泛的碱性环境适应性和稳定性。热稳定性增强的突变体酶在催化工艺中有着更高的操作稳定性和重复利用批次，具有实际应用意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种热稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2)属于D-2-羟基酸脱氢酶类，广泛存在于微生物和高等植物中，且分布于所有甲基营养型微生物之内，是一种非常保守的酶。NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶以同源二聚体形式存在，每个亚单位都有一个独立的活性中心，能够以价格低廉的甲酸钠作为底物，生成二氧化碳的同时将NAD⁺还原为NADH。该催化反应在常规条件下不可逆，副产物二氧化碳逸出到空气中，一方面可以驱使酶促反应不断向生成NADH的方向进行；另一方面，当甲酸脱氢酶与其它氧化还原酶耦联时，二氧化碳不会影响最终产物的提纯。上述优点使得甲酸脱氢酶在辅酶再生方面具有其独特的优势，是最具工业应用潜力的辅酶再生酶之一。

然而，野生型甲酸脱氢酶的比酶活低、对热和有机溶剂不稳定等特性，影响了其在工业化应用上的推广。目前，蛋白质工程已成为帮助野生型酶克服自身局限性的重要手段；Jiang Wei等人通过构建突变体V120S/N187D，将来源于Candida boidinii的FDH催化效率提升了1.5倍，Zheng Junxian等人通过构建突变体A10C，将来源于Candida boidinii的FDH在60℃条件下的半衰期增加了6.7倍。一般而言，反应温度每提高10℃，反应速率会变为原水平的两倍；酶的热稳定性越强，则越是能够在较长的时间内维持高反应速率，从而提高相应的时空产率或者减少反应过程中所需的酶量，最终降低生产成本。前期研究工作中，发明人已获得一种高酶活的LeFDH重组大肠杆菌工程菌，该大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的甲酸脱氢酶，但是该甲酸脱氢酶的热稳定性还有待进一步提高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明以数据库中来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶蛋白结构(PDB:5DN9)为模板，对亲本进行同源建模，选择亚基表面远离活性中心的非保守氨基酸残基进行突变，从而获得了热稳定性增强、底物亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体，为拓宽甲酸脱氢酶的工业化应用打下了基础。

本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甲酸脱氢酶的第21位的赖氨酸突变为脯氨酸，并将22位的赖氨酸突变为精氨酸获得。

本发明的第二个目的是提供所述的甲酸脱氢酶突变体的编码基因。

进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的重组质粒。

进一步地，所述的重组质粒是以pET系列载体为表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌。

进一步地，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：