[发明专利]一株IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法

权利要求书

1.一株IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、猪ACE2基因敲除载体的设计：NCBI查找猪ACE2基因基本信息并进行相关分析，针对敲除位点所在区域进行合理选择并进行设计，根据敲除位点的位置设计检测引物；

步骤2、猪ACE2基因敲除载体的制备：原始载体线性化后构建敲除载体并进行测序验证或PCR检测，检测无误进行无内毒素质粒中提；

步骤3、嘌呤霉素药杀浓度筛选及单克隆细胞生长能力测试；

步骤4、慢病毒包装并进行细胞侵染，期间持续药杀2d后进行Pool细胞检测，发现大量基因组被编辑的细胞经计数后通过有限稀释法分选并挑取单克隆细胞，其中部分用于基因组检测。

步骤5、敲除分析：根据基因组的测序结果进行核酸序列分析以及转录与翻译预测，观察在各敲除位点的作用下其基因组片段的缺失情况，通过对CDS翻译区域进行翻译预测，观察该蛋白提前终止翻译情况；

步骤6、免疫印迹检测IPEC-J2细胞ACE2基因突变后蛋白的表达。

2.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤1中，以ACE2基因结构域或结构域上游的外显子作为敲除位点的设计区域，敲除位点的选择要满足敲除效率高、脱靶效应低、在外显子和内含子交界处，不同位点不重叠的原则，最后将敲除位点标记在基因组序列上。

3.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤2中，PCR反应体系(20uL)：包括8uL ddH₂O，2uL 10×PCR Buffer，5uL Oligo-F/R，于98℃孵育3min后，每20s降低0.5℃，直至25℃左右；取上述杂交产物利用T4DNA连接酶将其与载体在16℃条件下连接1h后进行感受态转化，继续37℃培养过夜，挑取单克隆测序验证。

4.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤3中，嘌呤霉素浓度梯度设置为0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/mL，72h后无细胞存活的嘌呤霉素浓度即为筛选浓度；通过有限稀释法将细胞浓度控制在每100uL细胞悬液含1-1.5个细胞并接种96孔板，观察细胞是否存活。

5.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤4中，在载体总量不变的情况下，根据穿梭载体的大小，调整穿梭载体与辅助载体的比例，进行转染，收集培养液后进行慢病毒的浓缩与纯化便于后续细胞侵染。

6.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤5中，根据测序结果分析得出在3个不同位点作用下，其基因组同时出现两个片段的缺失，蛋白功能丧失。

7.根据权利要求1所述的IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，其特征在于，步骤6中，免疫印迹鉴定时，细胞蛋白提取步骤将筛选单克隆细胞的6孔板，PBS洗涤两次，加入蛋白裂解液，裂解5min，用细胞刮板将细胞刮进EP管，4℃，12000g/min离心20min，上清即为所需的蛋白溶液，BCA法测蛋白浓度并统一。