[发明专利]一株IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法

说明书

本发明提供一株IPEC‑J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，包括ACE2基因敲除载体设计、制备、慢病毒包装、单克隆株筛选及敲除分析等并获得ACE2基因敲除稳定细胞系。ACE2在抗炎及纤维化、肠道物质吸收转运及作为SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2的功能性受体，调控ACE2对机体健康意义重大。目前未有商品化IPEC‑J2细胞ACE2基因敲除稳定株，在一定程度上限制ACE2在猪肠道健康领域的研究。本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建出IPEC‑J2细胞ACE2基因敲除稳定株，为在动物尤其在猪上的研究提供高价值的生物材料，对猪肠道健康的研究具有重要的生物学意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)ACE2(Angiotensin converting enzyme 2)基因敲除稳定细胞株的构建、鉴定及方法归纳。

背景技术

血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000年首次报道的一种单羧肽酶，作为肾素-血管紧张素系统的关键调控蛋白，对维持机体全身或局部多种组织器官的功能稳态具有重要意义。近年来的研究发现，ACE2在抑制肠道炎症、协助肠道物质转运、维持肠道稳态方面意义重大。我们知道严重急性呼吸综合征(SARS)和新型冠状病毒肺炎(COVID-19)通常表现为呼吸系统疾病，但相当一部分患者表现出腹泻、呕吐和腹痛等胃肠道症状。ACE2作为SARS-CoV和SARS-CoV-2在肺泡上皮和肠上皮的天然受体，它不仅与呼吸道疾病的严重程度有关，而且与胃肠道疾病也密切联系。因而，调控ACE2对SARS冠状病毒介导的不良症状具有积极影响。由上，ACE2多种功能的发现使其成为一个新的疾病标志物和药物治疗靶点引起了国内外学者的广泛关注。特别是作为冠状病毒受体方面的研究是一个新的思路，但在动物方面特别是猪上的研究较少。

ACE2广泛存在于各种动物体内。基于人与动物间存在的种属差异性，单纯将ACE2在人SARS冠状病毒的作用与畜禽冠状病毒方面的作用分割开来，可能会造成忽视或淡化ACE2在畜禽冠状病毒的影响，即ACE2可以作为SARS-CoV和SARS-CoV-2的功能性受体，那么ACE2在动物上是否具有同样的作用，尤其ACE2是否会介导动物与人冠状病毒之间的交叉感染等都还不清楚，所以明确人和动物种属间ACE2基因差异的作用机制或靶点方面的研究势在必行。

在本发明研究中，以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)作为研究对象，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现IPEC-J2细胞中ACE2蛋白功能完全丧失，获得ACE2基因敲除稳定细胞株，这对于深入研究ACE2作为潜在病毒受体在猪冠状病毒(如PEDV、TGEV等)感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一株IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定细胞系。

本发明的第二个目的在于借助其探究ACE2在猪肠道炎症性病变中的作用及影响。

本发明的第三个目的在于借助其作为研究PEDV等猪冠状病毒的潜在功能受体的直接生物材料。

本发明的第四个目的在于深化CRISPR/Cas9基因编辑技术在兽医学研究领域的应用。其具体技术方案为：

一株IPEC-J2细胞ACE2基因敲除稳定株的细胞系及构建方法，包括以下步骤：

S1、通过NCBI查找猪ACE2基因的相关信息并进行分析。根据敲除位点所在区域进行合理选择，本设计以基因组结构域或结构域上游的外显子作为敲除位点的设计区域，接着通过在线设计软件设计敲除位点，并将敲除位标记在基因组序列上。针对上述再进行引物的设计，包括Oligo序列和测序引物的设计。