[发明专利]一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法

权利要求书

1.一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述制备方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，所述混合酶溶液为含酶全细胞，所述混合酶溶液是通过分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶、7β-羟基甾体脱氢酶及黄素还原酶的微生物发酵液，将混合的微生物发酵液通过30μm的陶瓷膜进行浓缩过滤得到。

2.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述混合酶溶液与底物牛磺酸鹅去氧胆酸反应完成后再次采用30μm的陶瓷膜进行过滤浓缩，得到二次含酶全细胞的混合酶溶液和含TUDCA的水溶液，回收所得到的二次混合酶溶液又充当所使用的混合酶溶液返回至酶与牛磺酸鹅去氧胆酸的反应中。

3.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶、7β-羟基甾体脱氢酶及黄素还原酶三种酶的微生物发酵液，发酵结束后分别检测发酵液中相应酶活力，并按照酶含量比例把三种发酵液进行混合，得到发酵液混液；

2)将步骤1)得到的发酵液混液通过陶瓷膜Ⅰ进行过滤浓缩，得到混合酶浓缩液，向得到的混合酶浓缩液中加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液后得到混合酶溶液，所述水溶液包括水，磷酸缓冲盐，葡萄糖和NAD+四种组分；

3)按照混合酶溶液体积下酶活力值对应的可投牛磺酸鹅去氧胆酸量，将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水按照比例进行混合配制得到牛磺酸鹅去氧胆酸溶液，同时用氨水将牛磺酸鹅去氧胆酸溶液调节至pH＝8，将pH＝8的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与步骤2)得到的混合酶溶液泵入反应器中进行反应，反应时间为30min，所述牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液泵入反应器中的速率控制为30min/次；

4)步骤3)中的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液反应完毕后，将反应液导入陶瓷膜Ⅱ中进行浓缩过滤后分别得到二次混合酶浓缩液及含TUDCA的水溶液，此时步骤2)中的陶瓷膜Ⅰ仍然在浓缩新鲜的混合酶溶液；

5)向步骤4)得到的二次混合酶浓缩液中加入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又返回至牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的反应中继续提供酶与底物进行反应；

6)将步骤4)得到的含TUDCA的水溶液导入非极性树脂的树脂柱进行吸附，含TUDCA的转化产物吸附在树脂柱上，向完成吸附后的树脂柱中通入混合解析剂对含TUDCA的转化产物进行解析，得到含TUDCA的解析液，经吸附之后的清液回流进入所述步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液体系中，如此实现该水溶液的循环使用；

7)用5％的盐酸溶液调节步骤6)中得到的含TUDCA解析液的pH至4～5，调节过程时间为25-35min，调节完毕后，搅拌养晶2h，后采用真空抽滤或者3000rpm离心处理，得到TUDCA湿成品及滤液，将TUDCA湿成品进行干燥即得到TUDCA成品。

4.根据权利要求3所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述采用多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法还包括：步骤8)向步骤7)得到的所述滤液中加入氢氧化钠固体，使所述滤液pH恢复至7.0～8.0，并将该滤液回流至步骤7)中的混合解析剂中，实现对混合解析剂进行重复利用。

5.根据权利要求3所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤1)中所述酶含量比例为100：80：1。

6.根据权利要求3所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤2)中所述水溶液的组成及混合比例为：水：磷酸缓冲盐：葡萄糖：NAD+为100：0.3：4：0.01，所使用的磷酸缓冲盐为钠盐或者钾盐。

7.根据权利要求3所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤3)中所述将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水进行混合的比例为1：4：0.1。