[发明专利]一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法

说明书

本发明公开了一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，涉及生物酶催化技术领域，解决现有制备牛磺熊去氧胆酸的方法转化率低、成本高、反应时间长、不易进行工业化生产等技术问题，所述制备方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，所述混合酶溶液为含酶全细胞，本发明采用含酶全细胞不仅保证了酶的活性，还大大降低了酶的成本；引入微反应理念，反应时间缩短至30min，节约了时间；本发明所提供的制备方法精简了制备过程、对酶循环回收利用，节约了成本，也显著提高了制备效率，所制备得到的TUDCA产物的含量及纯度都较高，达到了98％以上。

技术领域

本发明涉及生物酶催化技术领域，更具体的是涉及一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法技术领域。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。1902年自熊胆中发现，为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。

目前的TUDCA的工业化生产普遍为化学工艺，虽然近些年工艺不断优化改进，但总体来说化学法工艺复杂，收率低，成本高，环保和安全性差，这也是TUDCA价格居高不下的直接原因，这几年随着国内酶催化市场的普及，不少厂家及科研单位开始尝试酶催化生产TUDCA，但目前公开的文献和专利大部分仅是酶催化工艺的初步尝试，距离工业化生产还有不少距离。

发明专利CN107287272A公开了一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其分别构建含有7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶的表达载体或二者的共表达载体，在培养基中加入底物，发酵的同时进行转化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，此种方法底物浓度低、转化率低，反应中间体牛磺7-酮石胆酸含量高，转化周期长，不易进行工业化生产；针对后期纯化的方法中，专利CN107287272A采用了传统的萃取工艺，无法去除脂溶性杂质，又采用减压浓缩去除有机溶剂，不利于放大生产。

发明专利CN102994604B公开了一种两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，采用重组酶7α-HSDH和7β-HSDH对胆汁/粉中的结合态CDCA(包括TCDCA)进行原位催化生成结合态UDCA(包括TUDCA)，该方法没有使用辅酶再生系统，加入了大量的NADP+和NADPH，成本非常高，而且其实施例中转化率在55％～60％之间，转化率太低，后提取难度大，收率低，不具备放大生产条件；针对后期纯化的具体方法中，专利CN102994604B采用了多次超声处理，同时又使用了高速离心机以及旋蒸蒸发仪，涉及仪器设施昂贵，且操作复杂，不利于放大生产。

发明专利CN109402212A公开了一种生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，其第一步用的乳酸脱氢酶催化和α-酮酸生成乳酸，同时将NADPH转化成NADP+，第二步利用葡萄糖脱氢酶将葡萄糖转化成葡萄糖酸钠，同时将NADP+转化成NADPH，这两步生成大量的乳酸和葡萄糖酸钠，无法循环利用且不易回收，对后期污水处理产生很大压力，既不经济也不环保；针对后期纯化的具体方法中，专利CN109402212A使用了高速离心机以及旋蒸蒸发仪，涉及仪器设施昂贵，且操作复杂，不利于放大生产。

发明专利CN112391419A公开了一种牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法，其利用有机溶剂参与两步酶法催化生成TUDCA，该方法使用酶的用量和超滤范畴的0.1μm膜过滤器大大增加生产成本，且实施例中反应时间超过了15h，生产效率较低；针对后期纯化的具体方法中，专利CN112391419A采用了离心机、真空浓缩有机溶剂与一般工艺雷同，又使用了0.1μm膜过滤器，按照可工业化理论，该膜系统已涉及超滤范畴，使用、维护成本较高。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法。