[发明专利]一种唾液DNA提取的方法

说明书

本发明公开一种提取纯化唾液DNA的方法，包括以下步骤：1)预处理：将唾液与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球‑DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球‑DNA的复合体；3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球‑DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA。本发明提供的方法提取DNA的效率可达90％，提取的DNA可应用于STR复合扩增、DNA测序、DNA定量等下游。

技术领域

本发明属于DNA检测领域，具体涉及一种唾液DNA提取的方法。

背景技术

核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥；由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。有必要开发使用容易获取的样本，如头发、唾液等提取DNA用于分子生物学检测的方法。

唾液属于可以无损伤轻易提取的生物样品，其成分与血清、血浆中存在较大差异，难以使用相同或类似的试剂盒完成DNA提取：唾液为无色、无味、无嗅的液体；PH约6～7；唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物质；其中的大量粘蛋白、粘多糖使得唾液粘稠度达到水的仅20倍，这些成分也是唾液DNA提取中需要解决的主要问题、需要去除的主要物质。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于唾液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，所以有必要开发一种操作简单的磁珠DNA提取方法以提高提取效率、满足筛查、法医调查等用途中现场快速处理样本的需要。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明研发提供了一种简单、快速、高效的唾液DNA提取方法，适用于从在保护液中保存的唾液中提取DNA。

一种唾液DNA提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)：预处理：取唾液于离心管中，加入裂解液和蛋白酶K溶液混匀，将离心管放入56℃水浴锅中孵育15min；

(2)核酸吸附：向离心管中加入磁珠悬浮液与DNA结合液，涡旋震荡后室温静止5min；

(3)洗涤：将步骤(2)获得的混合物置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后，弃溶液，用洗涤液1和洗涤液2洗涤，最后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。

进一步地，步骤(1)中裂解液包含Tris 40-60mM，EDTA 10-20mM，NaCl 0.1-0.9M，十二烷基-N-甜菜碱0.1％-0.3％，GuHCl 60％-75％，NLS 0.6％-0.9％，TritonX100 3％-5％，NH4Cl 0.15％-0.24％、巯基乙醇0.5％-2.5％。优选地，裂解液包含Tris 55mM，EDTA15mM，NaCl 0.3M，十二烷基-N-甜菜碱0.2％，GuHCl75％，NLS 0.6％，TritonX100 3％，NH4Cl 0.18％、巯基乙醇1％。

进一步地，步骤(1)中蛋白酶K溶液的浓度为1.7-2.2mg/mL，优选浓度为2mg/mL。

进一步地，步骤(2)中DNA结合液为乙醇，异丙醇或乙二醇。优选65％-90％异丙醇。

进一步地，步骤(2)中磁珠悬浮液为为包被硅基的直径为50-1000nm的磁性微球水溶液。

进一步地，步骤(3)中洗涤液1为pH8.0、含50mM的Tris-HCl，200mM的氯化钠50％的乙醇溶液；洗涤液2为70-80％的乙醇溶液。