[发明专利]重组嗜盐单胞菌及构建方法与催化丙酮酸生产乙偶姻的应用

权利要求书

1.一种重组嗜盐单胞菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)在野生型嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD01保藏登记号为CGMCCNo.4353基因组上整合Mmp1 RNA聚合酶表达单元，得到Halomonas sp.TD1.0；再将Halomonas sp.TD1.0基因组上聚羟基烷烃酸合成酶亚基基因PhaC敲除，得到Halomonas sp.TD1.0△phaC；

所述Mmp1 RNA聚合酶表达单元的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述聚羟基烷烃酸合成酶亚基基因PhaC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(2)在高拷贝表达载体pN59上通过CPEC的方法，插入P_Mmp1，得到pN59-PMmp1，并在pN59-P_Mmp1的多克隆位点区域插入RBS-aldC-S2-alsS，得到高拷贝表达载体pN59-P_Mmp1-RBS-aldC-S2-alsS；

所述高拷贝表达载体pN59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述P_Mmp1为IPTG诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RBS为大肠杆菌Escherichia coli MG1655强核糖体结合位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述aldC为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的α-乙酰乳酸脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述alsS为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的α-乙酰乳酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)在低拷贝表达载体pN85上通过CPEC的方法插入P_Mmp1-RBS-aldC，得到低拷贝表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-aldC；

所述低拷贝表达载体pN85的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(4)向步骤(1)获得的Halomonas sp.TD1.0△phaC中导入高拷贝表达载体pN59-P_Mmp1-RBS-aldC-S2-alsS，得到重组嗜盐单胞菌TDZ-1；再向所述TDZ-1中导入低拷贝表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-aldC，得到重组嗜盐单胞菌TDZ-2。

2.权利要求1的构建方法构建的重组嗜盐单胞菌。

3.权利要求2的重组嗜盐单胞菌催化丙酮酸生产乙偶姻的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤：

1)权利要求2的重组嗜盐单胞菌在60LB液体培养基中进行培养，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，18-30℃下诱导12-16h，离心收集菌体；

2)按比例，向容器中加入底物丙酮酸，使终浓度为460-800mM，加入步骤1)获得的菌体，使OD₆₀₀＝5-15，加入10mM的MgCl₂，0.2mM硫胺素焦磷酸，余量为pH 6.0的100mM高渗磷酸缓冲液，混合均匀后在40-45℃，220rpm反应，得到乙偶姻。