[发明专利]重组嗜盐单胞菌及构建方法与催化丙酮酸生产乙偶姻的应用

说明书

本发明公开了重组嗜盐单胞菌及构建方法与催化丙酮酸生产乙偶姻的应用，重组嗜盐单胞菌的构建方法为：(1)在野生型嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD01CGMCCNo.4353基因组上整合Mmp1RNA聚合酶表达单元；再敲除PhaC基因；(2)制备高拷贝表达载体pN59‑P_Mmp1‑RBS‑aldC‑S2‑alsS；(3)制备低拷贝表达载体pN85‑P_Mmp1‑RBS‑aldC；(4)向步骤(1)获得的菌株中导入高拷贝表达载体和低拷贝表达载体，得到重组嗜盐单胞菌TDZ‑2。利用重组嗜盐单胞菌进行全细胞催化丙酮酸生产乙偶姻，与体外酶催化相比，效率高，反应周期短，成本低，环保。

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体涉及重组嗜盐单胞菌及构建方法与催化丙酮酸生产乙偶姻的应用。

背景技术

乙偶姻，又名3-羟基-2-丁酮，单体为无色或淡黄色液体，二聚体为白色结晶粉末。乙偶姻存在与很多食品中，具有奶香气味，常用作食品添加剂来提升食物中的奶香味。乙偶姻早前就被美国能源部列为30种值得优先开发的平台化合物之一，也是4-C平台化合物的一种，广泛应用于很多领域，如材料、医药生产和化学合成等领域，也是重要化学品如2,3-丁二醇，液态烃燃料和杂环化合物的前体物。

目前，乙偶姻工业化生产的主要方法是化学合成法和生物合成法。化学合成法主要包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解和丁二酮的部分加氢等方法。但由于这些工艺能耗大，得率低且对环境有一定的污染，所以近年来，利用生物法生产乙偶姻越来越受研究者的关注。

生物合成法主要有微生物合成法，体外酶催化合成法和全细胞催化合成法。

微生物生产乙偶姻的特点主要有：产量较高，但得率较低，生产周期长，主要原因可能是微生物代谢复杂，体内合成不易调控。因此也有研究者使用基于纯化酶的体外合成生物系统生产乙偶姻，目前已实现从2,3-丁二醇、丙酮酸、甘油、乳酸、木糖等生产乙偶姻。Cui等在体外酶催化体系中，利用α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶，催化395.6g/L丙酮酸生产了186.7g/L乙偶姻，达到理论得率的94.3％。但纯化酶系统存在目前还无法彻底解决的缺点，如酶的制备成本较高，酶的稳定性较低。

相比之下，全细胞催化具有很多明显的优势：制备简单，成本低，效率高，稳定性好等，目前已实现利用全细胞催化以meso-2,3-丁二醇，双乙酰，葡萄糖和乙醛为底物合成乙偶姻，且乙偶姻的产量都较高。Zhou等^[1]利用氧化葡糖杆菌全细胞催化生产乙偶姻，以2,3-丁二醇为底物，最终乙偶姻的产量达到165.9g/L。虽然乙偶姻的产量很高，但底物2,3-丁二醇价格昂贵。目前全细胞催化方法中，以乙醛为底物的催化体系中，乙偶姻的产量最高，达到222g/L^[2]，但该催化体系使用的细胞密度较高，达到30g CDW/L，且其底物乙醛较贵，难以储存，属于危险品，不利于乙偶姻的工业化制备。因此亟待开发一种利用廉价安全的全细胞催化方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重组嗜盐单胞菌。

本发明的第二个目的是提供一种重组嗜盐单胞菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种重组嗜盐单胞菌催化丙酮酸生产乙偶姻的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种重组嗜盐单胞菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)在野生型嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD01保藏登记号为CGMCCNo.4353基因组上整合Mmp1 RNA聚合酶表达单元，得到Halomonas sp.TD1.0；再将Halomonas sp.TD1.0基因组上聚羟基烷烃酸合成酶亚基基因PhaC敲除，得到Halomonas sp.TD1.0△phaC；

所述Mmp1 RNA聚合酶表达单元的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；