[发明专利]用于纯化人纤维蛋白原的离子交换层析用缓冲液及填料

说明书

本发明公开了一种用于纯化人纤维蛋白原的离子交换层用缓冲液及填料，该离子交换层析用缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。本发明属于血浆制品制备工艺领域。实验结果表明，利用本发明由平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液组成的缓冲液，配合离子交换层析用填料对人纤维蛋白原进行纯化，能够明显提高所得产品中人纤维蛋白原含量和纯度，还能明显降低产品中的病毒灭活剂残留。本发明提供的离子交换层用缓冲液及填料在纯化人纤维蛋白原中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于血浆制品制备工艺领域，特别涉及一种用于纯化人纤维蛋白原的离子交换层用缓冲液及填料。

背景技术

人纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)，也称人凝血因子Ⅰ，主要由肝脏实质细胞合成，是血浆蛋白的主要成分之一，血浆中纤原含量丰富，正常人血浆中约为2～4g/L，是凝血系统中的“中心”蛋白质之一。

人纤维蛋白原是凝血过程中凝血因子相继激活的最终底物，具有止血功能，它除了直接参与凝血过程后期阶段外，还能介导血小板聚集、影响血液黏度。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16-Gly17释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体I；在裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14-Gly15释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体II，暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca²⁺的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。除参与凝血外，人纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等。因此，制备高纯度的人纤维蛋白原在临床上具有重要价值。

目前采用较多的人纤维蛋白原纯化方法为层析纯化。申请号为201711104891.5的中国专利申请公开了一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。但是，该方法纯化步骤较复杂，需要先后经过赖氨酸亲和柱层析和阳离子交换柱层析；而且，该方法的病毒灭活工艺采用S/D法，但是经该方法纯化后的人纤维蛋白原中还有病毒灭活剂磷酸三丁酯残留。研究发现，磷酸三丁酯对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为602mg/kg，对人体有害(The use of tri(n-butyl)phosphate detergent mixtures to inactivatehepatitis viruses and human immunodeficiency virus in plasma and plasma'ssubsequent fractionation.Transfusion.1990 Sep；30(7):591-8.)。因此，需要开发操作更简单、病毒灭活剂磷酸三丁酯残留量更少的纤维蛋白原纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于纯化人纤维蛋白原的离子交换层用缓冲液和填料，以及其在纯化纤维蛋白原中的用途，以简化纤维蛋白原的纯化步骤，提高纤维蛋白原纯度，降低病毒灭活剂残留量。

本发明提供了一种用于纯化纤维蛋白原的离子交换层析用缓冲液，所述离子交换层析用缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液为2～8mM的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液由由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为20～60mM，Tris的浓度为2～8mM；所述洗脱缓冲液由由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为70～130mM，Tris的浓度为2～8mM。

进一步地，所述平衡缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗涤缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗脱缓冲液的pH为8.0～9.0。