[发明专利]自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法

权利要求书

1.自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：从血液样品中分离得到的单个核细胞按照0.5～5×10⁶个/ml细胞密度接种到预处理的培养瓶中，所接种的培养基含有10～50ng/ml A群链球菌OK432、10～50ug/ml抗CD3单克隆抗体、500～1000U/ml白介素-2、10～50ng/ml白介素-15、100～500ug/ml白介素-12、L-谷氨酰胺50～100mg/ml、和2～5％的自体灭活血浆或商品化的灭活血浆，5％CO₂ 37℃培养箱中培养3～5天；

步骤二：将细胞以0.5～1×10⁵/ml半量更换培养液，加入到新的抗CD16单克隆抗体包被的培养瓶中，培养液加500～1000U/ml白介素-2、10～50ng/ml白介素-15，换培养袋继续培养，每2～4更换加量的培养液并加同浓度的IL-2和IL-15，同时2～5％的自体灭活血浆或商品化的灭活血浆，培养至21天收获细胞。

2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法，其特征在于:预处理的培养瓶的制备方法：使用包括100～600ng/ml抗CD16单克隆抗体、0.1～1ug/ml纤维黏连蛋白(Fn)的D-PBS包被，4℃避光过夜，或37℃避光至少2小时。

3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法，其特征在于：自体灭活血浆的制备方法：将外周血移至离心管，2000～3000rpm，离心5～20min，吸取上清液；将上清液56℃，30min条件下灭活，然后4℃静置15min,2000～4000rpm离心，5～20min，再次吸取上清液制得，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法，其特征在于：细胞来源是外周血、脐血、骨髓或任何人体血液细胞。