[发明专利]自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法

说明书

本发明涉及生物领域，具体提供了一种自然杀伤细胞体外高效扩增的制备方法，所述方法包括预处理培养瓶，接种低密度单个核细胞以及有效抗体和细胞因子等的添加，所述方法成本低，能够显著提高NK细胞的扩增数量和扩增纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在体外扩增自然杀伤细胞的制备方法。

背景技术

70年代初美国国家癌症研究院(National Cancer Institute,USA)NCI的研究人员在研究T细胞对靶细胞的特异杀伤时发现正常对照小鼠的脾细胞可以象免疫小鼠的脾细胞一样杀伤某些肿瘤细胞，继而发现正常人外周血淋巴细胞也可以天然杀伤某些癌细胞。这些细胞的杀伤功能不需要预先免疫或致敏，故取名为自然杀伤细胞((natural killercells)。NK细胞是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的10％，在脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。

NK细胞较大，含有胞浆颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。以CD56+、CD16+、CD3-为免疫细胞特征，是一种特殊的淋巴细胞。NK通过识别细胞表面抗原簇self-MHC来区分正常细胞和非正常细胞。面对于正常细胞，NK处于非激活、非攻击状态；对于非正常细胞，包括病原体、被病毒感染的细胞、突变细胞、癌变细胞，一旦识别，就开启细胞毒(cytotoxicity)方式展开攻击并最终破坏靶细胞。NK细胞的细胞毒原理基本有两种，一种是NK细胞释放穿孔蛋白(perforin)和颗粒酶(granzyme)从而破坏靶细胞的膜完整性，导致靶细胞裂解；另一种是NK细胞通过引发细胞凋亡路径来杀死靶细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。之所以称作“自然杀手”，因为NK细胞与人体其它的150多种白细胞都不同，它不需要接受免疫系统的特殊指令，也不需要其它细胞的配合，自己单独就能识别和攻击外来细胞(如癌细胞)和病毒，在医学上被称作是“人体抵抗癌细胞和病毒感染细胞的第一道防线”。

目前，NK细胞培养存在两种培养方式：1、滋养层细胞(人肿瘤细胞，即人白血病K562细胞)培养方式。首先获得具有不分裂不增殖但仍保持代谢活性的滋养层细胞。该细胞通过基因工程技术进行改造，再经过钴60辐照，细胞膜表面稳定表达多种细胞因子，在多种细胞因子协同作用下，外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞得到定向激活和扩增。该种培养方式的价格相对便宜，仅有3000元左右。从培养结果来看，细胞收获量可达到20亿/L的水平，NK表型阳性率达到80％-90％左右。如Korean J Lab Med 2009；29:89-96，Koehl U etal.Klin2005；217:345–350)；(Blood，15March 2008，Vol.111，No.6，pp.3155-3162)等2、纯因子细胞培养方式：顾名思义就是使用相应的细胞因子来刺激单个核细胞，向NK细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，使NK细胞大量增殖。纯因子细胞培养技术以其安全性高而著称，其原因在于所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的。培养过程相当于模拟体内环境，促进NK细胞的激活及大量增殖。从培养结果来看，细胞收获量可达到15-25亿/L的水平，NK表型CD3-CD56+达到40％-90％左右。如：FehnigerT A.ShahMH.TurnerM Jeta1.Differentialcytokine and chemokinegene expression by human NKcellsfollowingactiva-tion withIL-18orIL-15incombination withIL-12：implications for the innateimmuneresponse[J].JImmunol，1999；162：4511-4520；EspluguesE，Vega-RamosJ，CartoixaD eta1.Induction of tumor NK—cellimmunitybyanti-CD69 antibodytherapy[J].Blood，2005；105：43994406等,但由于NK细胞在体内数量较少，制约了其大规模研究试验。因此，研制高效的体外扩增技术是NK细胞过继免疫治疗研究进展的关键。