[发明专利]一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法

权利要求书

1.一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：包括pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒；所述pML-Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因，所述pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接，所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由TaU3p启动子驱动表达，所述pJM-sgRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、sgRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，所述sgRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒中的Pj23119启动子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述TaU3p启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：所述sgRNA4TmC+5结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法，其特征在于：所述DNA末端集合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.如权利要求1-6任意一项所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具，其特征在于：其编辑方法具体包括以下步骤:

S1、质粒导入：先将权利要求1-6任一所述的一种CRISPR-Cas9基因编辑工具中的pML-Cas9质粒导入小麦中，使得pML-Cas9质粒上的Cas9基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将权利要求1-5任一所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统中的pJM-sgRNA质粒导入小麦中；

S2、基因敲除：需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cas9质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成小麦基因的编辑过程。