[发明专利]一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法

说明书

本发明公开了一种CRISPR‑Cas9基因编辑工具及其编辑方法，包括pML‑Cas9质粒以及pJM‑sgRNA质粒；pML‑Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因，pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接，pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，本发明涉及基因工程技术领域。该CRISPR‑Cas9基因编辑工具及其编辑方法，可实现小麦等作物CRISPR‑Cas9载体转化后突变率低、获得CRISPR‑Cas9转基因突变株系难的问题，节约了转化时间，减少了转化成本。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法。

背景技术

基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中接近一半的基因(46％)有3-4个拷贝，12％的基因有1-2个拷贝，42％的基因拷贝数≥5个，因此迫切需要在小麦中建立重组酶介导的基因叠加转基因操作系统，实现DNA叠加/删除，并利用该系统，在小麦中开发具有自主知识产权的目标株系。与传统的基因组编辑技术ZFN和TALEN相比，利用CRISPR-Cas9定点突变，成本更低，更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，对小麦基因功能的研究具有重要意义。

现如今小麦等作物中突变率高、获得CRISPR-Cas9转基因突变株系难，转化时间长，且转化成本较高，因此，本发明提出一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法，以解决上述提到的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法，解决了现如今小麦等作物中突变率高、获得CRISPR-Cas9转基因突变株系难，转化时间长，且转化成本较高的问题。