[发明专利]一种NK细胞培养方法

权利要求书

1.一种NK细胞快速扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

第0天：首先，往培养瓶加入1～10ugCD3、10～40ug胸腺肽及10～20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2～4h，包被结束吸出包被液待用；其次，取1×10⁶-3×10⁶个/ml的单个核细胞进行接种处理；再其次，加入10～40ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在20～100ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO₂的培养箱中，进行细胞培养；

第3天：往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；

第6天：往培养瓶中加入50～150ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；

第9天：往培养瓶中加入200～400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；

第12天：往培养瓶中加入450～650ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；

第15天：往培养瓶中加入1000～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；

第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述NK细胞培养基包括如下步骤：

第0天：首先，往培养瓶加入5ugCD3、20ug胸腺肽及15mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁3h，包被结束吸出包被液待用；其次，取2×10⁶个单个核细胞进行接种处理；再其次，加入22.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在50ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO₂的培养箱中，进行细胞培养；

第3天：往培养瓶中加入31.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；

第6天：往培养瓶中加入133ml激活培养基和14v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；

第9天：往培养瓶中加入300ml，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；

第12天：往培养瓶中加入500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；

第15天：往培养瓶中加入1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；

第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第0天细胞培养中，加入激活培养基和自体灭活血浆，使初始体积为25ml。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第3天细胞培养中，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为35ml，并控制培养瓶中总体积为60ml。