[发明专利]一种NK细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种NK细胞培养方法，包括步骤：往CD3、胸腺肽及PBS溶液包被处理的培养瓶内装入单个核细胞、含细胞因子IL‑15、IL‑18、IL‑2和CD16的激活培养基，随后对细胞进行静态培养；第3和6天，分别添加一定数量的含细胞因子IL‑15、IL‑18、IL‑2和CD16的激活培养基；第9、12和15天，分别添加含细胞因子IL‑2的扩增培养基；第18天，停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。该培养方法，NK细胞生长速度快，18天培养周期，NK细胞数量可以达到1122～1343倍；有效NK细胞活率达到91％以上，且该NK细胞适用于临床应用。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法。

背景技术

肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。

肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法；其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。

NK细胞，又称自然杀伤细胞(natural killer cell)，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种NK细胞培养方法。

本发明的技术方如下：

一种NK细胞快速扩增的培养方法，包括如下步骤：

第0天：首先，往培养瓶加入1～10ugCD3、10～40ug胸腺肽及10～20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2～4h，包被结束吸出包被液待用；其次，取1×10⁶-3×10⁶个/ml的单个核细胞进行接种处理；再其次，加入10～40ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在20～100ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO₂的培养箱中，进行细胞培养；

第3天：往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；

第6天：往培养瓶中加入50～150ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；

第9天：往培养瓶中加入200～400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；

第12天：往培养瓶中加入450～650ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；

第15天：往培养瓶中加入1000～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；