[发明专利]一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒

说明书

本发明提供了一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT‑qPCR预混液，RT‑qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品。其中，RT‑qPCR预混液由一步反应RT‑qPCR缓冲液，以及登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针组成。该试剂盒具有灵敏、精准、高效的优点。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒。

技术背景

登革病毒（dengue virus）是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一类在病毒结构和基因组水平都高度保守的病毒群体。登革病毒通过蚊媒进行传播，主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，引起登革热以及发病率和死亡率均很高的登革出血热和登革休克综合征。形态学上，登革病毒是直径约为50nm的包膜球型病毒，由于登革病毒E蛋白以首尾相连的方式形成二聚体规则地排列在病毒表面，因此呈现出20面体对称的构象。登革病毒的基因组RNA约含有11000个核苷酸，基因组只有一个开放读码框，5’端和3’端均有一段非编码区。病毒5’端为I型帽子结构，四分之一编码病毒3个结构蛋白（C、PrM和E）；病毒3’端缺乏poly（A）尾，四分之三编码7个非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。这些蛋白是以多聚蛋白形式进行翻译合成后，由宿主蛋白酶切割而形成的。目前，登革病毒的检测方法主要有病毒分离培养法、免疫学方法、普通RT-PCR等。病毒分离培养法实验要求高且周期长，无法快速检测病毒；免疫学方法虽然灵敏度高，但存在假阳性偏高和交叉反应等问题，且不适用于病毒种鉴别；普通RT-PCR方法存在容易造成扩增反应产物污染、敏感性不够等问题。

登革热是全球和我国严重的蚊媒传染病之一，其防控形势及挑战日益严峻，对我国人民健康和国家生物安全造成严重威胁。据研究显示，携带登革病毒的埃及伊蚊和白纹伊蚊雌蚊可通过垂直感染的方式，将登革病毒传给下一代，这是登革病毒持续存在于环境中的重要机制之一。在登革热疫情中，同时进行伊蚊监测和登革病毒检测，能对伊蚊携带病毒情况进行及时评估并指导灭蚊工作，从而降低疫情扩散的风险。

蚊虫是对人类危害严重的病媒生物之一。蚊虫不仅侵扰叮咬人类，影响人们的工作和休息，被蚊子叮咬后，被叮咬者的皮肤出现起包和发痒等症状，还可引起过敏反应，造成奇痒和红肿；并且登革热、流行性乙型脑炎、疟疾等多种高致病性、高病死率的传染病都和蚊虫叮咬有关，属于蚊媒传染病。伊蚊是蚊科库蚊亚科伊蚊属蚊虫，是蚊科中最大一属，更是凶猛的刺叮吸血蚊虫，分布范围广泛，在我国各省（区）都有分布。伊蚊监测和种群分类工作，是登革热等蚊媒传染病防控的基础。目前，蚊虫分类鉴定工作主要以蚊卵、蛹、幼虫及成虫的外部形态为依据。但在实际采样和监测工作中，运用传统的形态分类方法，蚊卵、蛹和幼虫的正确鉴定需要喂养羽化至成蚊，耗费时间长；蚊虫中存在多种形态相似的种群，应用形态学分类方法无法达到蚊虫复合体、近缘种等鉴别的需要；成蚊受采集方法、采集工具和卫生消毒等的影响，经常出现腹部鳞片或翅等重要体征脱落和受损的情况，难以运用形态学方法进行分类。

多重PCR反应是指在同一反应中实现多个基因序列的特异性扩增和检测。运用荧光检测技术，在经优化设计的多重PCR反应体系中加入不同荧光标记的探针，一对引物对应一个特异性的荧光探针，检测不同靶标的探针携带不同光谱范围的荧光基团，巧妙的把核酸扩增、光谱分析和实时检测技术结合在一起，利用荧光信号积累监测PCR反应的进程。多重荧光 PCR 技术可同时检测多种目标片段，大幅度提高工作效率，具有灵敏、准确、快速等特点，在蚊媒监测和病原微生物快速检测方面均具有不可替代的作用，应用前景广泛。