[发明专利]衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用

权利要求书

1.衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的衰老相关差异表达基因为如下基因的一种或多种组合：SIRT3、E2F3、IRS2。

2.根据权利要求1所述的衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的细胞衰老诊断试剂盒是通过分析细胞中衰老相关差异表达基因的蛋白表达情况，和/或m6A RNA甲基化修饰水平，从而诊断细胞衰老情况：

(1)当分析结果为如下情况的一种或多种组合时，判断细胞进入衰老状态：

a.SIRT3蛋白表达升高；

b.E2F3蛋白表达升高；

c.IRS2蛋白表达升高或降低；

d.SIRT3 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

e.E2F3 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

f.IRS2 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

(2)当分析结果为如下情况的一种或多种组合时，判断细胞为复制性衰老细胞：

a.IRS2蛋白表达降低；

b.IRS2 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

(3)当分析结果为如下情况的一种或多种组合时，判断细胞为早衰细胞：

a.SIRT3 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

b.E2F3 m6A RNA甲基化修饰水平升高；

细胞中衰老相关差异表达基因的蛋白表达情况和m6A RNA甲基化修饰水平，均以年轻细胞为对照，采用相对定量分析法确定。

3.根据权利要求1或2所述的衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的年轻细胞的定义为：群体倍增水平PDL小于或等于其寿命的50％的细胞；

所述的复制性衰老细胞的定义为：群体倍增水平PDL大于或等于其寿命的90％的细胞；

所述的早衰细胞为年轻细胞应激诱导的衰老细胞，应激因素包括但不限于氧化应激；

其中，PDL的计算公式为n＝3.32(logN2-logN1)+X，N2为该代细胞收获的细胞总数，N1为上代接种的细胞数，X为上代细胞的PDL。

4.根据权利要求1或2所述的衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的细胞衰老情况通过以下步骤诊断：

(1)提取待测细胞总蛋白，以年轻细胞为对照，进行待测细胞中衰老相关差异表达基因的蛋白半定量；

(2)提取待测细胞总RNA；RNA甲基化免疫共沉淀法富集m6A RNA甲基化片段，洗脱，纯化，得到待测样品；取待测样品进行逆转录和实时荧光Q-PCR定量；

(3)根据步骤(1)所得衰老相关差异表达基因的蛋白半定量结果和步骤(2)所得衰老相关差异表达基因的m6A RNA甲基化水平检测结果诊断细胞衰老情况。

5.根据权利要求1或2所述的衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的衰老诊断试剂盒中含有衰老相关差异基因蛋白提取试剂、蛋白特异性抗体和Western blot实验试剂、m6A RNA甲基化片段富集试剂和扩增引物，以及m6A RNA甲基化测序和分析试剂中的一种或多种组合。

6.根据权利要求5所述的衰老相关差异表达基因在制备细胞衰老诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

所述的扩增引物包括：

SIRT3-F：5'-GACCAACATGCTAGAAGTGCGG-3'；

SIRT3-R：5'-AAGCTCGGCATCTGTTGGTTAC-3'；

E2F3-F：5'-AAACCTTTCTCCTCTGGCCTCC-3'；

E2F3-R：5'-CAGGGGAGGCAGTAAGTTCACA-3'；

IRS2-F：5'-CTGTGAGAGCAGTGGGTGATGA-3'；

IRS2-R：5'-TGGAGTCTGAATGCCTAGCCAG-3'。