[发明专利]一种基于非洲猪瘟病毒P30、P72蛋白的病毒样颗粒的制备与应用

权利要求书

1.表达ASFV病毒P30-Spycatcher融合蛋白的pET-28a原核表达载体pET-28a-P30-SC，序列特征为SEQ ID No.4。

2.表达ASFV病毒P72-Spycatcher融合蛋白的pET-28a原核表达载体pET-28a-P72-SC，序列特征为SEQ ID No.5。

3.表达蛋白-Spycatcher融合蛋白的基因，包含ASFV P30、P72蛋白和Spycatcher标签蛋白，蛋白与标签之间以一段柔性肽连接，P30-SC氨基酸序列特征为SEQ ID No.6，P72-SC氨基酸序列特征为SEQ ID No.7。

4.一种基于非洲猪瘟病毒P30、P72蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，构建表达载体pET-28a-P30-SC和pET-28a-P72-SC并表达纯化融合蛋白，将大肠杆菌原核表达系统纯化的P30-SC、P72-SC融合蛋白在缓冲液中，分别与表面展示ST标签蛋白的重组T7噬菌体颗粒T7-ST共同孵育，验证结合情况，通过板式化学发光实验对制备的病毒样颗粒颗粒的免疫原性进行评估。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述构建表达载体pET-28a-P30-SC和pET-28a-P72-SC并表达纯化融合蛋白，具体包括以下步骤：

(1)ASFV P30、P72基因的PCR扩增：以实验室现存基因所在质粒为模板，设计无缝克隆引物扩增P30、P72蛋白编码基因用于pET-28a-Spycatcher原核载体连接；

(2)Spycatcher基因的合成：将Spycatcher基因序列合成于pET-28a原核表达载体之上，在序列N段加上一段柔性肽序列，得到pET-28a-Spycatcher表达载体，核苷酸序列为SEQID No.8；

(3)表达P30-SC、P72-SC原核表达载体的构建及蛋白纯化：通过无缝克隆，将P30、P72基因序列分别克隆至pET-28a-Spycatcher原核表达载体上，得到pET-28a-P30-SC重组质粒，序列特征为SEQ No.4和pET-28a-P72-SC重组质粒，序列特征为SEQ No.5；重组质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株，经过蛋白纯化获得P30-SC、P72-SC融合蛋白。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述表面展示ST标签蛋白的重组T7噬菌体的构建方法为：通过T7噬菌体展示技术，将外源SpyTag蛋白基因片段插入到T7噬菌体基因组中，通过体外包装，获得表面展示ST蛋白的T7噬菌体。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)首先通过基因合成获得ST基因，基因N段加入一段柔性肽，合成序列两端加入EcoRI和Hind III限制性酶切位点序列及相应的保护性碱基，序列特征为SEQ ID No.1；

(2)重组噬菌体基因的构建：通过EcoR I和Hind III两种限制性内切酶双酶切合成的ST基因，之后通过T4连接酶将酶切产物与T7载体臂相连接，从而获得重组噬菌体基因组；

(3)体外包装：将步骤(2)中连接产物与T7包装提取物混合孵育，获得完整的含有重组基因组的T7噬菌体颗粒；

(4)噬菌斑分析：通过双层琼脂培养法，对包装产物进行噬菌斑计数，从而计算噬菌体滴度；

(5)文库鉴定：蛋白酶K法提取T7 DNA，然后用T7通用引物进行PCR鉴定，最终得到所需要的噬菌体；

(6)文库扩增：使用液体裂解液法对噬菌斑进行扩增，待菌液变澄清后，离心将细胞碎片去除；通过PEG/NaCl沉淀法，对上清中的噬菌体进行浓缩，之后通过噬菌斑计数测定浓缩后的噬菌体滴度。

8.利用权利要求4所述方法制备的病毒样颗粒在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。