[发明专利]一种基于非洲猪瘟病毒P30、P72蛋白的病毒样颗粒的制备与应用

说明书

本发明公开了一种表面展示非洲猪瘟病毒P30、P72蛋白的重组病毒样颗粒的制备与应用，通过T7噬菌体展示技术，将SpyTag标签蛋白展示于T7噬菌体表面，从而构建了一种工程化噬菌体(T7‑ST)。同时，通过大肠杆菌原核表达系统，表达纯化了P30‑Spycatcher和P72‑Spycatcher融合蛋白。在适当的缓冲体系中，将T7‑ST与P30‑SC、P72‑SC两种融合蛋白分别混合孵育，最终得到表面展示P30‑SC、P72‑SC蛋白的重组VLP颗粒。通过VLP制备的新型基因工程疫苗，具有免疫保护效果突出、安全性好、抗原纯度高等特点。还能为机体提供多重保护。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表面展示非洲猪瘟病毒P30、P72蛋白的病毒样颗粒(VLP)颗粒的制备及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(Infection with African swine fever virus，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)感染家猪和野猪而引起的一种急性、出血性的烈性传染病。急性型非洲猪瘟起病快，病程短，以高热、食欲不振、发紫、内脏大出血、病死率近100％为特征^[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病和重点防范的外来动物疫病之一。我国自2018年8月暴发首例ASF以来，截止2019年6月6日，已有32个省份累计暴发137起疫情(OIE和农业农村部统计数据)，几乎席卷我国所有省份和地区。我国作为世界猪肉产量最大国(约占世界总产量的50％)，这场突如其来的ASF疫情对我国的养猪业构成巨大威胁^[2]。

ASFV为有囊膜的双链DNA病毒，是非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是迄今发现的唯一DNA虫媒病毒。胞外病毒粒子直径约为200nm，由内核(Internal core)、内核心壳(Core shell)、内膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)、囊膜(External envelope)形成的同心多层20面体对称结构组成^[3]。ASFV基因组为170-190kb的线性双链DNA，含有约150-181个开放阅读框，编码约150-200种蛋白^[4]。内核心壳由PP220、PP62等多聚蛋白构成。内膜在电子显微镜下为单脂膜^[5]，主要来源于内质网膜，包含p54、p17、p12蛋白。衣壳由2 000多个六边形壳粒组成，主要为p72蛋白，占病毒粒子总量的33％，衣壳蛋白p72、pE120R介导成熟病毒粒子从病毒工厂到细胞膜转运、出芽排出，p72具有促进病毒蛋白折叠/降解的伴侣分子样作用，可募集Hsp70促进病毒蛋白的折叠。P54和P30蛋白参与病毒附着的两个不同步骤，介导ASFV病毒与细胞受体之间的特异性相互作用，并且都有助于抗体介导的保护性免疫应答^[6]，其中P30蛋白在病毒感染细胞的内化过程中起作用^[7]。由于ASFV生物学特性的复杂性，迄今未能研制出安全有效的疫苗^[8]。P30、P72蛋白在病毒感染过程中的重要作用，使其成为疫苗开发、抗体治疗和基于抗原的诊断检测的重要靶点。

噬菌体展示技术经过20年的发展完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等^[9]。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，因此人们可以在基因分子克隆基础上实现蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。T7噬菌体展示技术具有稳定性高、特异性强、表达量高、操作简单、易于富集等优势^[10]。利用T7噬菌体展示技术将外源蛋白展示于噬菌体表面，可制备重组VLP颗粒。通过VLP制备的新型基因工程疫苗，具有免疫保护效果突出、安全性好、抗原纯度高等特点。同时，还能为机体提供多重保护，有效刺激动物机体产生细胞免疫、体液免疫、粘膜免疫，为机体打造全方位免疫保护，具有良好的应用前景。

发明内容