[发明专利]一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法

权利要求书

1.一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)外植体获取:对菜用豌豆种子作消毒无菌处理，并播于基质中并浇透无菌水，光照培养箱培养；生长5-9天后，在植株子叶节的上端或下端沿斜下45度角将植株切断，获得地上部分待侵染外植体；

2)侵染：用菌糊对所述待侵染外植体切割产生的伤口进行裹菌，所用的菌种为发根农杆菌AR1193；接着，将已裹菌的外植体种植于基质，加入浇5ml包含发根农杆菌AR1193的液体培养基；

3)发状根诱导及组合苗形成：侵染后的所述外植体，避光黑暗培养24h；之后转移至光照培养箱培养，整个过程用塑料罩密封保湿，培养10-18天；然后继续培养两周，提前两天打开塑料罩上的通风孔缓慢降低湿度，接着完全移除塑料罩，获得生长健壮的组合苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述的植株子叶节的上端指紧邻植株子叶的交界处上端；所述下端指紧邻植株下胚轴交界处的上端。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中生长时间优选7天；所述步骤3)中培养时间优选18天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1或2中所述基质的配制方法为：蛭石和草炭按照3比1的质量比例混合，在121℃，20min高压灭菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述发根农杆菌AR1193携带含GUS报告基因的双元表达载体pCAMBIA3301。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述菌糊刮取自发根农杆菌AR1193的TY固体培养基；所述发根农杆菌AR1193的TY固体培养基通过下述方法制备：取200μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌划线涂板于TY固体培养基，并于28℃恒温培养箱中倒置培养48h；其中所述TY固体培养基含50mg/L Kan。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述包含发根农杆菌AR1193的液体培养基通过以下方法制备：取10μL发根农杆菌菌株AR1193甘油菌接种到1mL的TY液体培养基，于28℃恒温培养箱中以180rpm的转速培养12h；再取200μL发根农杆菌菌液接种到200mLTY液体培养基中，在28℃摇床上过夜震荡，培养至OD600＝0.6-1.0；所述TY液体培养基含50mg/L Kan。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述消毒无菌处理具体为用75％的次氯酸钠对所述菜用豌豆种子消毒15min，无菌水冲洗5-6遍。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1或2中所述光照培养箱的培养温度控制在22℃，光周期为16h光照，8h黑暗。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述菜用豌豆种子为成熟无病虫害的种子。