[发明专利]一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法

说明书

本发明公开了一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法，包括如下步骤：1)外植体准备；2)切根侵染；3)毛状根形成。本发明采用发根农杆菌介导作为介导，一步法诱导形成菜用豌豆毛状根，明确了最佳切割方式、苗龄和培养时间，成本低，节约空间，降低了污染率，提高了实验操作的便捷性。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，属于一种发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系建立的方法，尤其是一步法建立发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法。

背景技术

豌豆(Pisum.sativum L.)是世界第二大食用豆类作物，根据用途可分为粮用豌豆(干豌豆)、食用嫩豆粒的菜用豌豆(甜豌豆、青豌豆)及食用嫩荚的菜用豌豆(荷兰豆)。我国青豌豆的总产量居世界首位，在世界豌豆生产中占有重要的地位。豌豆具有固氮能力，是一种环境友好型作物，具有减肥增效、改良土壤等作用，在我国可持续发展农业系统中发挥重要作用。2019年，法国学者报道了第一个注释的染色体级别的豌豆参考基因组，基因组大小约4.45Gb，由7对同源染色体组成(2n＝2x＝14)，将加速功能基因的挖掘利用及遗传改良。

转基因技术是研究植物基因功能及其作用机制的重要手段，也是性状改良的途径之一，目前应用最为广泛的转基因方法主要是农杆菌介导法，其中包括根癌农杆菌介导法和发根农杆菌介导法。现已报道的由根癌农杆菌介导的豌豆及其它多数豆类的转基因转化周期长，污染率高，转化率低下，基因稳定转化难度很高，因此利用发根农杆菌诱导形成携带目标基因的毛状根这一策略已在大豆、菜豆等豆科作物中得到广泛应用。该技术的一般原理是利用发根农杆菌诱导植物地下部分形成转基因发状根，从而获得一种组合苗(composite plants)，其地下部分是转化体，地上部分是非转化体。发根农杆菌介导法包括两步法和一步法。现已有报道通过发根农杆菌介导豌豆毛状根遗传转化技术获得转基因发状根组合苗，如附说明书附图1(Irina et al.,2019)，这一方法属于两步法。一步法相比两步法，转化周期进一步缩短，污染率进一步降低，提高了实验操作的便捷性。一步法策略目前仅在梨和大豆有报道(Mandal et al.,2019；Fan et al.,2020)，在豌豆上尚未见相关报道。此外，与大豆种子发芽生长过程中子叶出土不同，豌豆种子在发芽生长过程，子叶不出土。因此，有必要针对菜用豌豆建立一种高效的发状根转基因体系，要求操作简便、成本低廉、转化效率高、重复性好、试验周期短、污染率低。本发明拟建立一步法发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法，优化组合出具有较高转化率和生根率的最佳切割位置、苗龄和培养时间，以进一步节约实验成本，缩短试验周期，降低污染率，提高实验操作的便捷性。

发明内容

本发明针对现有两步法豌豆发状根遗传转化体系的诸多缺点，以及现有体系未对菜用豌豆的毛状根生根率和阳性率及最佳切割位置、苗龄和培养时间进行优化组合等问题，通过一步法诱导豌豆发状根遗传转化及优化组合切割位置、苗龄和培养时间，提供一种一步法建立发根农杆菌介导的菜用豌豆高效遗传转化体系的方法，为菜用豌豆功能基因组研究提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种发根农杆菌介导的菜用豌豆遗传转化体系建立的方法，包括如下步骤：

1)外植体获取:对菜用豌豆种子作消毒无菌处理，并播于基质中并浇透无菌水，光照培养箱培养；生长5-9天后，在植株子叶节的上端或下端沿斜下45度角将植株切断，获得地上部分待侵染外植体；

2)侵染：用菌糊对所述待侵染外植体切割产生的伤口进行裹菌，所用的菌种为发根农杆菌AR1193；接着，将已裹菌的外植体种植于基质，加入浇5ml包含发根农杆菌AR1193的液体培养基；

3)发状根诱导及组合苗形成：侵染后的所述外植体，避光黑暗培养24h；之后转移至光照培养箱培养，整个过程用塑料罩密封保湿，培养10-18天；然后继续培养两周，提前两天打开塑料罩上的通风孔缓慢降低湿度，接着完全移除塑料罩，获得生长健壮的组合苗。在该步骤用于促进毛状根的产生。