[发明专利]一种用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述用于检测静脉血栓代谢的标志物为PAI‑1(4G/5G)、F5(G1691A)两个基因，试剂盒针对PAI‑1(4G/5G)、F5(G1691A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、PAI‑1(4G/5G)测序引物、F5(G1691A)测序引物和阳性对照。本发明以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对静脉血栓风险评估相关的基因多态性进行检测，为静脉血栓风险评估临床个性化用药给出基因角度的建议。

技术领域

本发明涉及一种用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism，VTE)是由遗传、环境、行为等多种因素共同作用的疾病，VTE的发生50％～60％可归因于遗传因素现已知的遗传因素在东西方人群中存在较大差异，蛋白C缺陷、蛋白S缺陷以及抗凝血酶缺陷是亚洲人群主要的遗传缺陷类型，主要表现为深静脉血栓形成(DVT)和肺血栓栓塞(PE)。随着临床工作对该疾病的关注及医疗卫生事业的发展，静脉血栓在亚洲发病率逐年上升。突变及基因多态性在疾病发生中发挥重要作用。遗传因素表现出明显的地域和种族差异性。

纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)基因启动子区域4G/5G多态性：作为组织和尿纤溶酶原激活物的主要抑制物，PA1-1能抑制活性纤溶酶的产生。PAI-1的过度表达可导致纤溶系统受损进而增加血栓栓塞事件的风险单鸟瞟吟核昔插入/删除(4G/5G)变异位于PAI-1基因的启动子区域,可影响PAI-1的表达量进而对纤溶系统产生影响。等位基因4G与PA1-1水平升高有关，可增加VTE的发生风险在亚洲人群中该多态性与血栓栓塞风险也存在相关关系，且风险高于高加索人群。

凝血因子V基因Leiden突变(factorVLeiden，FVL)是遗传性易栓症中最常见的类型，属常染色体显性遗传，分为纯合型及杂合型，杂合子形成血栓的风险较正常人高5～10倍，而纯合子可高达80倍。凝血因子VLeiden是指凝血因子V基因的一个位点发生突变，使编码蛋白的密码子发生改变，致使所编码的凝血因子V虽可正常激活，但对APC产生抵抗，导致血液中凝血酶含量增高，患有静脉血栓栓塞(VTE)的风险增大。F5编码凝血因子V(FV)突变已明确为静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism,VTE)的原发性危险因素。F 5突变纯合子发生静脉血栓的风险大大增加，这种血栓形成风险与活化蛋白C(ActivatedProteinC，APC)抵抗有关，APC可以水解活化因子V(activatedfactorV，FVa)成为具有抗凝作用的FVac，还可以间接降低凝血酶原的活性，刺激纤溶酶原激活物的释放，增加纤溶活性。F5基因突变产生的APC抵抗与FVac生产障碍有关。

目前，对于基因多态性检测的方法主要有直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉的检测基因多态性的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于静脉血栓风险评估的检测试剂盒的技术方案如下：

本发明的快速反应试剂盒针对PAI-1(4G/5G)、F5(G1691A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、PAI-1(4G/5G)测序引物、F5(G1691A)测序引物、阳性对照。

优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：