[发明专利]一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使用引物对pMT-E2-F/E2-Fc'-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5'端部分序列的E2-Fc'片段；

2)人工合成猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列，并保留猪源IgG3Fc蛋白的二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列；

3)使用引物对E2'-Fc-F/pMT-Fc-R，分别步骤2)中IgG3Fc或IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E23'端部分序列的E2'-Fc或E2'-ΔFc片段；

4)以步骤1)中所述E2-Fc'片段与步骤3)中所述E2'-Fc或E2'-ΔFc片段为模板进行重叠PCR，得到的重叠PCR扩增产物为APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段；

5)将果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA和APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段用EcoR I/Xho I限制性内切酶进行双酶切，连接，得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc；

6)将所述pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc与潮霉素抗性质粒共同转染果蝇细胞系，经筛选，得到表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系；

所述步骤1)与步骤2)～3)之间没有时间顺序限制。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中pMT-E2-F的核苷酸序列如SEQID NO:6所示；

所述E2-Fc'-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

IgG3ΔFc核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述pMT-E2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述E2-Fc'-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4)中重叠PCR扩增用引物对为E2'-Fc-F/pMT-Fc-R；

E2'-Fc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

pMT-Fc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

7.权利要求1～6任意一项所述制备方法制备得到的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系。

8.一种具有猪非典型瘟病毒免疫原性的融合蛋白，其特征在于，由权利要求7所述重组果蝇细胞系表达得到的E2Fc融合蛋白或E2ΔFc融合蛋白；

所述E2Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述E2ΔFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

9.权利要求7所述重组果蝇细胞系或权利要求8所述融合蛋白在制备预防仔猪先天性震颤的疫苗中的应用。

10.一种预防仔猪先天性震颤的疫苗，其特征在于，包括权利要求8所述融合蛋白和佐剂。