[发明专利]一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒

权利要求书

1.一种表达框，其特征在于，所述表达框中膜定位信号肽、荧光蛋白及亲和分选标签的编码序列。

2.如权利要求1所述表达框，其特征在于，所述膜定位信号肽包括膜外定位信号肽及跨膜结构域；其中，膜外定位信号肽包括BY55,DAF,CEAM7中的一种；所述跨膜结构域为ITB3,ITA5,ITAV中的一种；

优选的，所述膜定位信号肽为膜外定位信号肽，所述膜外定位信号肽通过糖基磷脂酰肌醇分子锚定于细胞膜脂质双分子层的外层；

优选的，所述跨膜结构域C端参与信号转导氨基酸的编码序列缺失。

3.如权利要求1所述表达框，其特征在于，所述亲和分选标签位于荧光蛋白的N端；

优选的，所述亲和分选标签为钙调蛋白结合肽，麦芽糖结合蛋白、HIS-Tag蛋白标签，或Twin-Strep-tag中的一种，具体的，为Twin-Strep-tag；

进一步的，所述表达框中，包括膜外定位信号、绿色荧光蛋白和TST的编码序列；

进一步的；所述表达框中包括膜外定位信号肽、绿色荧光蛋白和GST的编码序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中包括权利要求1-3任一项所述表达框。

5.如权利要求4所述表达载体，其特征在于，所述表达载体包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒；

优选的，所述表达载体的为天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体；进一步的，所述噬菌体载体或黏粒载体为pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、卡隆4A和卡隆21A；

优选的，所述质粒载体为pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。

6.一种转染阳性细胞的亲和分选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求4或5所述表达载体、磁珠及宿主细胞；

优选的，所述宿主细胞为真核细胞，包括贴壁细胞及悬浮细胞；所述贴壁细胞包括Lenti-X293T细胞及前列腺癌细胞22Rv1；所述悬浮细胞包括白血病细胞K-562及Jurkat细胞；

进一步的，所述宿主细胞为K-562细胞；

优选的，所述磁珠表面具有亲和分选标签的配体蛋白修饰；进一步的，所述配体蛋白为Strep-Tactin蛋白；具体的实例中，所述亲和分选标签为Twin-Strep-tag，所述磁珠为Magrose Strep-Tactin磁珠。

7.一种转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，所述分选方法包括将目的基因导入权利要求1-3任一项所述表达框或权利要求4或5所述表达载体，并在宿主细胞中进行DNA转染，通过磁珠分离转染阳性细胞。

8.如权利要求7所述转染阳性细胞的亲和分选方法，其特征在于，分选方法具体步骤如下：将目的基因导入所述表达载体，将表达载体转入宿主细胞进行DNA转染，所述转染时间为36-48小时，收集细胞并洗涤，将洗涤后的细胞与含有磁珠的缓冲液混合，孵育一段时间后形成磁珠-细胞复合物，固定所述磁珠-细胞复合物，移除体系中的缓冲液以及其中未被磁珠结合的细胞，再加入洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，即获得转染阳性细胞；

优选的，所述磁珠-细胞复合物的固定方式包括通过外加磁场进行固定和自然沉降方式；

优选的，所述DNA转染方法包括磷酸钙共沉淀法，转染试剂转染，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装；

优选的，所述细胞为贴壁细胞时，需要采用胰酶进行消化；

优选的，所述洗涤后的细胞加入含有磁珠的缓冲液后，在室温条件下孵育10～20min；

优选的，所述分选方法中，清洗和孵育使用的缓冲液为含有0.05～0.15％BSA的DPBS溶液；

优选的，所述分选方法还包括对阳性转染细胞进行定量的方法，进一步的，通过检测荧光蛋白的荧光强度进行定量；具体的实例中，通过流式细胞仪进行定量。