[发明专利]一种阳性转染细胞亲和分选方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种阳性转染细胞亲和分选试剂盒及方法。为了克服难转染细胞中基因递送效率低的难题，本发明提供了一种亲和细胞分选系统，可有效分选转染阳性细胞。本发明构建了一系列可靶向定位细胞膜外表面的细胞亲和纯化标签，在转染阳性的细胞中表达带有亲和标签的EGFP荧光蛋白，并在GPI膜定位信号的作用下定位到细胞膜表面，基于亲和标签和配体之间的高亲合性相互作用，通过配体偶联的磁珠将转染阳性的细胞分离进行检测和定量。该分选方法在操作简单、分选获得的细胞损伤较小，对基因表达和功能具有较小的干扰，可继续培养或直接用于下游实验，尤其适合在难转染细胞中解决转染效率低的难题。

技术领域

本发明属于阳性转染细胞分选技术领域，具体涉及一种表达框、包含所述表达框的表达 载体、试剂盒，以及一种基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签阳性转染细胞分选方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为 承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近年来，体外基因传递研究取得了重大进展。不管是病毒介导还是非病毒介导的基因传 递，对于大多数细胞都可以得到较高的转染效率，然而在难以转染的细胞比如淋巴瘤/白血病 细胞以及原代细胞中的转染效率却依旧不如人意。如何在难转染细胞中进一步提高阳性率成 为以这些细胞为基础的功能研究的关键问题。

在转染效率无法进一步提高的情况下，通过细胞分选从转染的细胞混合物中富集阳性细 胞是一种有效的提高阳性细胞比例的策略。现有的方法主要包括抗生素药物筛选，流式细胞 荧光分选(FACS)和磁性细胞分选(MACS)等方法。由于不需要特殊的设备，用带有编码抗药 性基因的质粒载体实现耐药性阳性细胞筛选的方法在细胞生物学和基因功能研究中得到了广 泛的应用。然而，一方面筛选药物的毒性可能会对研究结果带来不可预知的影响，另一方面， 该方法更适合用于贴壁细胞的筛选，在悬浮细胞中因为难以分离死亡与存活的细胞而受到限 制。并且，由于每种细胞株对药物的敏感性存在较大的差异，在实际应用中需要设计预实验 来探索合适的抗生素浓度，使其仅杀死未发生转染的阴性细胞，让具有耐药性的转染阳性细 胞存活下来，因此，存在操作复杂以及实验周期较长的问题。FACS方法通过在质粒载体上 引入荧光蛋白的表达框，如EGFP,mCherry,RFP,YFP,BFP等，依据转染阳性细胞具有的荧光 特性在流式细胞仪上实现阳性细胞的分选。该方法需要有分选功能的流式细胞仪，仪器价格 昂贵，实验成本高，通量小，受限于仪器的分选速度，且耗时长。MACS方法则借助磁性微 球偶联蛋白抗体和靶细胞表面标记蛋白的相互作用，使转染阳性细胞在外部磁场中实现分离。 比如，通过质粒载体在细胞表面表达小鼠H-2Kk16、LNGFR17等分子，然后用可与H-2Kk亲 和结合的磁珠、或者与LNGFR分子的融合标签亲和结合的磁珠孵育，可实现转染阳性细胞的 分选。然而这些分子本身具有重要的生物学功能，在细胞表面过量表达这些分子可能会严重 干扰细胞的基因表达和表型，给实验研究带来潜在的不可预知的影响。

因此目前本领域仍缺少一种操作快速、简单，成本低，适用性广，并且对细胞干扰较小 的富集转染阳性细胞的方法。

发明内容

为了克服现有转染阳性细胞分选系统的局限性，本发明构建了一种新的基于磁珠亲和分 选的细胞分离系统，可快速、高效的富集转染阳性细胞。

具体的，本发明提供以下技术方案：

本发明主要的技术贡献在于，构建了一种可高效分选转染阳性细胞的亲和分选系统，通 过在表达载体上编码融合了膜定位信号、亲和标签标记的荧光蛋白，荧光蛋白和膜定位信号 在转染阳性的细胞融合表达。基于该亲和分选系统，膜定位信号将荧光蛋白定位到细胞膜外 表面，确保技术人员可以直观的通过流式细胞仪或者荧光显微镜来评估转染阳性细胞比例， 另一方面，荧光蛋白上融合的亲和标签让技术人员可以通过磁珠分选的方式来快速高效的分 离转染阳性细胞。