[发明专利]一种含非天然氨基酸蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种基因密码子拓展组合物，包括：

(1)一种或多种氨基酰-tRNA合成酶，结合突变的tRNA；

(2)一种或多种突变的tRNA，所述突变的tRNA反密码子环上突变为终止密码子的互补序列；

其中，氨基酰-tRNA合成酶能将突变的tRNA结合到非天然氨基酸上产生氨基酰-tRNA；所述非天然氨基酸选自NAEK、Anap、pAcF；

其包括以下三组氨基酰-tRNA合成酶与突变tRNA的组合：

来自马氏古甲烷球菌的MmPylRs和tRNA^MmPyl_UCA的所述氨基酰-tRNA合成酶与突变tRNA组合；

来自大肠杆菌的EcLeuRs和tRNA^EcLeu_CUA的所述氨基酰-tRNA合成酶与突变tRNA组合；

以及

来自大肠杆菌的EcTyrRs和tRNA^EcTyr_UUA的所述氨基酰-tRNA合成酶与突变tRNA组合。

2.一种在动物细胞中表达含有非天然氨基酸重组蛋白的方法，包括：

(1)制备重组蛋白表达盒，其中重组蛋白编码序列中非天然氨基酸的密码子设置为终止密码子；

(2)改造动物细胞，使其表达权利要求1中基因密码子拓展组合物中的氨基酰-tRNA合成酶和突变tRNA的组合；

可选的，进一步突变eRF1以削弱eRF1与mRNA、和/或eRF1与核糖体的结合；

(3)将步骤(1)中重组蛋白表达盒导入步骤(2)改造的动物细胞，制备重组动物细胞；

(4)将步骤(3)构建的重组动物细胞在补充添加非天然氨基酸的培养基中培养，诱导含有非天然氨基酸重组蛋白的表达。

3.如权利要求2所述在动物细胞中表达含有非天然氨基酸重组蛋白的方法，其特征在于：

(1)所述重组蛋白氨基酸序列中含有一种、两种或三种非天然氨基酸；或

(2)在动物细胞中表达一种、两种或三种含有非天然氨基酸的重组蛋白，各重组蛋白中含有的非天然氨基酸种类相同或不同。

4.一种提高动物细胞中表达含非天然氨基酸重组蛋白通读率的方法，包括使突变的eRF1和含有PTC的mRNA在同一动物细胞内表达，其中，所述动物细胞中表达有权利要求1所述基因密码子拓展组合物中的氨基酰-tRNA合成酶和突变的tRNA；所述突变的eRF1削弱了eRF1与mRNA、和/或eRF1与核糖体的结合。

5.如权利要求4所述提高动物细胞中表达含非天然氨基酸重组蛋白通读率的方法，其中与野生型eRF1相比，所述突变的eRF1对mRNA、和/或核糖体具有较低的结合能力，并且所述突变的eRF1包括E55R、E55D、Y125F、N129P位点的突变。

6.如权利要求5所述提高动物细胞中表达含非天然氨基酸重组蛋白通读率的方法，其中突变的eRF1包括E55R突变体、E55D突变体、Y125F突变体、N129P突变体。

7.权利要求1所述基因密码子拓展组合物在重组表达含非天然氨基酸重组蛋白中的应用；其中所述重组表达以哺乳动物细胞为宿主，

所述含非天然氨基酸重组蛋白包括：

含有一个、两个或三个非天然氨基酸的一种重组蛋白，或者

分别含有至少一个非天然氨基酸的两种或三种重组蛋白。