[发明专利]一种含非天然氨基酸蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及一种在动物细胞中表达含有非天然氨基酸重组蛋白的方法，在四组氨基酰‑tRNA合成酶和相应tRNA的基础上，构建识别终止密码子的氨基酰‑tRNA，筛选获得三种基因密码子拓展系统。所述三种基因密码子拓展系统对终止密码子通读效率高、相互兼容性强，从而可以在一条外源蛋白上插入三种非天然氨基酸、或对同一细胞的三条外源蛋白上分别插入不同的非天然氨基酸。为进一步提高通读率，还对释放因子eRF1进行了突变以减弱其与终止密码子的相互作用。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种含非天然氨基酸蛋白的制备方法，尤其涉及一种在哺乳动物细胞中实现一个蛋白同时高效定点插入三种不同非天然氨基酸的方法。

背景技术

自然界中总共有64个三联体密码子，在一般的生物体中，其中61个密码子编码20种天然氨基酸，而另外三种密码子(UAA,UGA,UAG)不编码任何氨基酸，当核糖体翻译到这些密码子的时候，会有正常的终止因子来终止蛋白质翻译。随着更多的生物学现象被揭示，科学家们发现在古细菌中，终止密码子之一的琥珀终止密码子UAG被用来编码特殊的氨基酸到必须的蛋白质中，以保证细菌正常的生长。基于此，科学家们将古细菌中的tRNA和tRNA合成酶对单独拿出来，经过正负筛选的优化，使其在大肠杆菌中利用本来不编码氨基酸的UAG密码子，来编码自然界中不存在的氨基酸(即非天然氨基酸)到蛋白质的特定位置。

基于不同体系的非天然氨基酸已经被发现并应用于研究工作中，包括酪氨酸体系，吡咯赖氨酸体系，苯丙氨酸体系，大大丰富了非天然氨基酸结构的选择；而越来越多的物种，包括大肠杆菌，哺乳动物细胞，酵母，昆虫细胞等，都可以进行非天然氨基酸的插入，也为这套技术的广泛应用奠定了基础；在插入方法上，从最早的琥珀终止密码子，到其他终止密码子，四联体密码子，稀有密码子，甚至优化的特殊核糖体等，为插入方法提供了更多的选择。

基因密码子扩展技术从开发至今，已经在分子探针、药物靶标发现、药物改良修饰以及各种生化领域上得到了很广泛的应用。通过引入不同的非天然氨基酸，科学家们可以选择性的赋予蛋白质更新型的性质，以发现更多的生命科学中的奥秘。尽管如此，基因密码子扩展技术掺入氨基酸仍然存在效率低下、易错配等技术问题。在氨基酸掺入中，有可能会出现三种类型的错配：(1)tRNA/aaRS；(2)aaRS/aminoacid；and(3)tRNA/codon。体内将氨基酸类似物掺入蛋白质的一种方法就是借助于氨酰tRNA合成酶的疏漏，催化某种氨基酸类似物连接到tRNA从而进入蛋白质。在非天然氨基酸掺入中，能够避免所有三种错配的tRNA/aaRS需要设计相应的正交系统，仅仅在有其相应密码子的正确的位点插入新的氨基酸。也就是说，要扩展遗传密码，将新的氨基酸引入生物合成体系，需要有识别正交密码子的tRNA、对应的能将非天然氨基酸装上tRNA的高特异性aaRS，从而实现非天然氨基酸的掺入。正交系统需满足：唯一的新密码子，能识别新密码子的tRNA，能与其偶联的aaRS；并且，aaRs/tRNA组合必须与内源的aaRS/tRNA组合是正交的(即不可交叉使用)，以保证非天然氨基酸掺入的精度。

包括抗体在内的蛋白质药物是国际上发展最快、利润最高、竞争也最激烈的研发领域,然而几乎所有蛋白质药物都存在以下共性的重大缺陷：①在体内易被蛋白酶降解致半衰期过短；②分子量大免疫源性强,机体注射诱导体内产生中和抗体致药效不断降低；③不能定点修饰,缺乏像小分子药物进行构效关系的系统研究手段等。这些瓶颈困扰着蛋白质药物，特别是质量控制和药效方面的整体发展。

在蛋白质药物的改良上，通过将含有苯丙酮的非天然氨基酸引入到蛋白质的特定位点，并基于苯丙酮和羟乙胺的化学偶联反应，美国的Ambrx公司已开发了一系列蛋白质药物新产品，包括双功能抗体，抗体药物偶联物等。除此外，借助琥珀终止密码子(UAG)和DNA定点突变技术，在干扰素或者其他蛋白药物的多个潜在的可修饰位置上引入了含叠氮基团的非天然氨基酸作为修饰“把手”，进而通过Click反应与含DIBO基团的不同分子量的PEG分子进行偶联。同时对引入非天然氨基酸的条件以及PEG的偶联条件进行了优化，成功建立了蛋白质药物温和、快速、高效、定量和特异的修饰方法。