[发明专利]检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法

权利要求书

1.一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，包含如下试剂：

(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有六种儿茶酚胺及其代谢物：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为1ng/mL～3000ng/mL；

(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；

(3)内标液：包含6种儿茶酚胺及其代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的去甲肾上腺素-D6·HCl、20ng/mL的甲氧基肾上腺素-D3·HCl和20ng/mL的3-甲氧基酪胺-D4·HCl，100ng/mL的肾上腺素-D6·HCl、100ng/mL的多巴胺-D4·HCl、50ng/mL的甲氧基去甲肾上腺素-D3·HCl；

(4)缓冲液I；

(5)缓冲液II；

(6)衍生液。

2.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，六种儿茶酚胺及其代谢物在六种校准品中的浓度分别为，校准品1中浓度均为1ng/mL；校准品2中浓度均为3ng/mL；校准品3中浓度均为12ng/mL；校准品4中浓度均为60ng/mL；校准品5中浓度均为400ng/mL；校准品6中浓度均为3000ng/mL。

3.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相A：0.1-0.5％甲酸水溶液；流动相B：80-90％甲醇水溶液或纯甲醇。

4.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7-9；所述缓冲液II为1M醋酸钠溶液，pH 5-7。

5.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述衍生液为80％的乙醛溶液。

6.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述质控品QCL的浓度为4ng/mL，质控品QCM的浓度为1250ng/mL，质控品QCH的浓度为2500ng/mL。

7.根据权利要求1或2所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，校准品溶液的制备方法如下：使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液，配制含3000ng/mL的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液依次稀释得到400ng/mL的校准品5，60ng/mL的校准品4，12ng/mL的校准品3，3ng/mL校准品2以及1ng/mL的校准品1。

8.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，质控品的制备方法如下：用健康人尿液或人工合成尿液配制浓度为2500ng/mL肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人尿液或人工合成尿液稀释得到1250ng/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到4ng/mL的QCL。

9.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，内标液的配制方法如下：

使用15％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸肾上腺素-D6、盐酸多巴胺-D4、盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸去甲肾上腺素-D6、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，其中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的盐酸甲氧基肾上腺素-D3、20ng/mL盐酸3-甲氧基酪胺-D4、20ng/mL盐酸去甲肾上腺素-D6，50ng/mL盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3，100ng/mL肾上腺素-D6和100ng/mL盐酸多巴胺-D4。

10.一种采用权利要求1至9任一项所述的试剂盒进行人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)处理试剂；

将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL冻干粉、质控品QCM冻干粉和质控品QCH冻干粉中分别加入超纯水，室温静置待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；

(2)衍生反应；

将待测样本溶液、校准品溶液、质控品分别加入对应的进样瓶中；然后在每个进样瓶中加入内标溶液，涡旋震荡混匀；最后加入缓冲液I、缓冲液II和衍生液，涡旋震荡混匀，置于37-60℃温浴5-40分钟；

(3)超高效液相色谱分离；

流动相A为0.1-0.5％V/V甲酸水溶液，流动相B为80-90％甲醇水溶液；

采用梯度淋洗的方式进行分离；

(4)质谱检测

在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数；

(5)建立校准曲线：以标准物的浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，得到线性拟合方程；

(6)计算待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度。