[发明专利]一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备

权利要求书

1.一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片，其特征在于：

所述尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

所述结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应15-20h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu₂O₃置于烧杯中，加入10ml 20％稀盐酸搅拌溶解，80-100℃加热近干，除去过量HCl，加入20ml无水乙醇溶解，得2mmol EuCl₃的无水乙醇溶液，记为产物II；

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至6-7，出现大量沉淀；加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌6-12h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物IV；

称取25mg产物IV、3.5-11mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mgAIBN，N₂保护，65℃下反应24h后，取50ml无水甲醇加入到反应液中，产生白色沉淀，无水乙醇洗涤两次，去离子水洗涤三次，得到产物V；

将产物III溶于30ml DMF，称取2mmol产物V溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至6-7，在50-60℃水浴锅中搅拌24-48h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl 0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。