[发明专利]一种培养脐带组织间充质细胞的方法

权利要求书

1.一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、脐带组织间充质细胞分离：

采集脐带组织，消毒、清洗后，剪成长度为2～3cm的段，剥离华通式胶，剪碎至1～2mm³的块状，备用；

二、外泌体的制备：

选择P3-P5代的脐带间充质干细胞，使用无血清培养基培养48-72h后，收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤，然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液，加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物，经0.22μL滤膜过滤除菌，得外泌体浓缩液蛋白，-80℃冷藏备用；

三、将步骤一分离得到的华通式胶加入到含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基中培养，培养期间每隔3-5天换液一次，共换液2次；所述的含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基是由浓度为20～30ml/L的外泌体浓缩液蛋白液、20-25ml/L的血小板裂解液、0.8-1ml/L的低分子肝素钠和1.5-1.8g/L的海藻糖组成；其中，华通式胶与培养基的比例为(2-3)g：(11-15)mL培养基，即完成所述的培养脐带组织间充质细胞的方法。

2.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤一中所述的脐带组织为病毒检测合格的脐带组织。

3.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤是指：收集培养上清，在转速为1000-1300×g条件下离心10-15min后，经0.45μm无菌滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液是指：以1 000-1300×g转速、4℃的条件下离心40-50min，收集上清得外泌体浓缩液。

5.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物是指：加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，以100000×g转速、4℃的条件下离心40-50min，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，以100000×g转速离心40-50min，收集固相物。

6.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的培养上清与蔗糖溶液的体积比为30～40:1.5。