[发明专利]一种培养脐带组织间充质细胞的方法

说明书

一种培养脐带组织间充质细胞的方法，它涉及细胞培养领域。本发明提供一种采用外泌体培养脐带组织间充质细胞的方法。本发明从脐带组织中获取华通式胶，然后从脐带间充质干细胞获取得到外泌体，利用所获取的外泌体加入到培养基中培养华通式胶，以缩短培养周期，并在短时间内提高细胞数量。本发明应用于脐带组织间充质细胞培养领域。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种培养脐带组织间充质细胞的方法。

背景技术

脐带为新生儿与母体链接的纽带，新生儿出生后废弃的组织，在脐带内含有大量的华通式胶，华通式胶内含有大量的脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤。脐带间充质干细胞具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床应用中被重视。对于成人来说，干细胞主要来源于脂肪和骨髓，脂肪干细胞具有来源充足，取材方便，对人体造成的创伤也较小，可反复取材，容易分离，获取细胞量大，也是临床应用的重要种子细胞的来源。临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。间充质干细胞在皮肤修复与再生领域取得了很多进展，干细胞主要通过旁分泌的方式来促进皮肤创伤的修复。由于脐带为新生儿废弃物，并且不存在伦理问题，所以脐带间充质干细胞的获取日益被重视和研究，通过添加外泌体对脐带组织华通式胶进行培养从而能够快速分离出大量脐带间充质干细胞目前很少被研究和报道。

外泌体作为一种由细胞分泌的亚细胞成份，能够参与细胞之间的交流，属于细胞外囊泡的范畴，细胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成份，是一组纳米级颗粒，包括外泌体，微粒，微囊泡，凋亡小体等，外泌体广泛存在于体液中，如血液，淋巴液，脑脊液等。在电镜下呈杯状或双凹圆盘状，直径为30-150nm，具有一定的疏水性，外泌体内含多种蛋白及核酸成分，蛋白质是外泌体发挥功能的重要载体。外泌体是细胞间通讯的基本媒介，因为多种miRNAs、蛋白质、细胞因子都存在于外泌体中，因此外泌体可以通过运输受体与配体或者相关的遗传物质，在长距离或短距离的细胞信号和物质传递中均起重要作用，干细胞来源的外泌体还具有稳定性高、无免疫排斥、归巢效应、剂量和浓度易于控制等优点，正是由于外泌体的这种特殊功能，推断在细胞代谢，培养及冻存过程中能够较好的维持细胞所需的营养和生长环境，保持细胞的干性和活性。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种采用外泌体培养脐带间充质细胞的方法，以缩短培养周期，并在短时间内提高细胞数量。

本发明的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：

一、脐带组织间充质细胞分离：

采集脐带组织，消毒、清洗后，剪成长度为2～3cm的段，剥离华通式胶，剪碎至1～2mm³的块状，备用；

二、外泌体的制备：

选择P3-P5代的脐带间充质干细胞，使用无血清培养基培养48-72h后，收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤，然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液，加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物，经0.22μL滤膜过滤除菌，得外泌体浓缩液蛋白，-80℃冷藏备用；