[发明专利]一种生物催化的高纯度NMN生产工艺

说明书

本发明涉及一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，S1、构建重组表达载体，S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，S5、离心收取上清，进行HPLC反应。本发明的优点：成本低，生产工艺简单等优点。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体是指一种生物催化的高纯度NMN生产工艺。

背景技术

NMN全称β-烟酰胺单核苷酸，是人体内长寿蛋白的辅因子NAD+的前体之一。进入体内可迅速变成NAD+,对人体健康发挥着根本性的影响，主导人体内数百项生命活动，掌控着疾病和衰老的节奏。

NAD+分子量过大，无法直接口服吸收补充，其体内主要依赖于细胞合成，但合成量很低，并且老年人体内自行组成NAD+的水平远远达不到所需水平，大量前沿科学研究表明：NMN可直接促进NAD+在体内的自我生成，是补充NAD+的最理想管道。补充NMN可有效的提升体内的NAD+的含量，并显著减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命。近期研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用。

但是目前大部分的NMN来源于化学合成，生产率较低，产品纯度低，含有约50％的手性分子NMN，有毒、难分离、故收率非常低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重。

近年来，生物催化技术已用于NMN的生产，这是一种绿色生物转换，对环境污染几乎为零，不产生手性分子NMN，产率高，成本低，是NMN生产技术的一次重大革命。但是它们所设计的合成方法相对比较复杂，且转化率和收率普遍不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是解决上述问题，提供一种提供转化率和收率的生物催化的高纯度NMN生产工艺。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种生物催化的高纯度NMN生产工艺，包括以烟酰胺核苷为底物，用含有烟酰胺核苷激酶全293F细胞，进行一步法高效制备β-烟酰胺单核苷酸，表达式为：

所述酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质。

编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因。

一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞包含用于制备NMN的烟酰胺核苷激酶的基因的重组表达载体。

所述宿主细胞为293F细胞。

一种制备高纯度NMN的方法，包括以下步骤：

S1、构建重组表达载体，

S2、利用重组表达载体转化宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞，

S3、培养遗传工程化的宿主细胞，持续性表达烟酰胺核苷激酶，

S4、添加底物烟酰胺核苷，继续培养细胞，利用摇瓶法培养或发酵罐培养，

S5、离心收取上清，进行HPLC反应。

所述步骤S3为将构建好的稳转烟酰胺核苷激酶全293F细胞，在摇瓶中使用无血清培养基进行培养，调整密度为5-6million/ml。

所述步骤S4为在培养基中加入50mM烟酰胺核苷，在37℃下，摇动反应4h。