[发明专利]一种他克莫司代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种他克莫司代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒检测他克莫司代谢标志物CYP3A5*3 6986AG的基因多态性，试剂盒针对CYP3A5*3 6986AG多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、CYP3A5*3 6986AG测序引物和阳性对照。本发明采用样本处理液快速样本释放出DNA，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增，可以得到足量的基因组DNA吸附在磁珠上供后续分析，通过将样本和裂解混合液移除可以去除大部分抑制物。

技术领域

本发明涉及一种他克莫司代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

他克莫司是临床上广泛用于肝、肾、心、肺、胰等器官移植患者的免疫抑制治疗，其主要不良反应包括继发性感染、肾毒性、神经毒性、胃肠反应、代谢障碍以及淋巴增生性疾病和肿瘤等。然而其治疗窗窄、药动学个体差异大，常规按体重剂量进行给药，部分受者由于给药剂量过低造成移植物的排斥导致移植失败或者给药剂量过高导致感染及肝、肾毒性等不良反应发生。常规治疗药物检测(TDM)并不能完全反映其药效作用，即当受者需要增加免疫抑制作用时，升高血他克莫司浓度并不一定能达到理想的免疫抑制效应，反而发生排斥反应及加大晚期移植失败的风险。CYP3A5在他克莫司的代谢中起重要作用，其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高，不良反应增加。CPIC指南建议携带CYP3A5*3/*3基因型的移植患者减少他克莫司的用药剂量，以避免发生药物不良反应。

CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可的松、尼菲地平等多种药物的代谢。CYP3A5基因第3内含子内22893位存在6986AG的突变(rs776746，CYP3A5*3)，该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪接，引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白，从而使其失去酶的活性，因此CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下降。目前已报道CYP3A5的SNP位点有三十多个，其中*3位点突变(3号内含子6986A＞G突变)导致DNA转录提前终止，是决定CYP3A5表达和酶活性最关键因素。CYP3A5*3位点的突变可将酶活性分为快、中和慢三种类型。

目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光PCR。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法试验成本较高。

目前对血液DNA的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。CN201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应。该发明也同样需要对磁珠进行洗涤。因此，急需建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的焦磷酸测序方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种他克莫司代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的他克莫司代谢标志物的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：

所述他克莫司疗效预测的基因多态性检测试剂盒针对CYP3A5*3(6986AG)的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、CYP3A5*3(6986AG)测序引物、阳性对照。

具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：