[发明专利]一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺

说明书

本发明公开了一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺，通过优化甘油添加量和添加方式，其创新点在于增加甘油的补料量，提高诱导前生物量，同时在甲醇诱导阶段，在甲醇中混合甘油进行诱导，提高菌体的生长速度和产物合成速度，缩短培养时间，发酵水平提高了39.50%，节约生产成本，提高了发酵效率，适合于大规模发酵生产，为生产企业提高经济效益。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺。

背景技术

胶原蛋白在人体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%~33%，因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用，故开发胶原蛋白的人工合成是一件非常有意义的事情。

重组毕赤酵母外源型表达胶原蛋白是目前常用的胶原蛋白生产方式，其具有表达量高，可规模化生产、无动物源的病毒污染风险等特点，但在发酵过程中，发酵时间长，能耗高，发酵工艺繁琐，因此开发一种保证产量，并缩短培养时间的方法就尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺，通过优化诱导前后甘油使用量，提高毕赤酵母的生长速率，加速胶原蛋白合成，缩短了发酵周期，降低了胶原蛋白的降解水平。

本发明的技术方案如下：

步骤1）：将种子液按照10％的接种量接种到5L的发酵培养基（10升发酵罐）中，发酵温度为28℃，罐压0.05Mpa，氨水控pH为4.5~5.0，调节转速、通气量和补料控制溶氧＞35.0%，待溶氧陡然上升，进入甘油流加阶段，流加50％甘油，流加量为90~160g/L。

步骤2）：流加结束后，待溶氧＞80%以上，进入甲醇诱导阶段，通过溶氧反馈调节甲醇（含PTM1 4.35mL/L）流加速度，并在甲醇中添加0~15%的甘油，溶氧控制20％。

优选的，在步骤1）中，流加50％甘油中，加入4.35mL/L 的PTM1。通过申请人大量实验发现，在前期步骤中，流加50％甘油的时候，加入PTM1，可以提高毕赤酵母的生长速率，加速胶原蛋白合成。

例如中国专利申请CN111733200A公开了一种通过调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺，其工艺是先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中流加PTM1，与本发明不同在于，其应用PTM1的方式是在甲醇诱导阶段加入。

优选的，在步骤1）中，所述的最佳的甘油流加量为120g/L。

优选的，在步骤2）甲醇诱导阶段，所述的氨水控pH为6.0。

优选的，在步骤2）甲醇诱导阶段，所述的甘油添加量为10%。

本发明中所述的毕赤酵母为GS115毕赤酵母表达菌，购买北京百欧博伟生物技术有限公司，为公开菌种。

本发明所述的发酵培养基参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：85％H₃PO₄26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。