[发明专利]鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法

说明书

本申请公开了一种鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用，引物组包括终浓度比为1.6：0.2：0.8的内引物、外引物和环引物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID No.1‑6所示。试剂盒添加WarmStart LAMP变色预混液,64℃反应30分钟即可终止反应。本申请能够同时鉴定禽腺病毒血清8a型和禽腺病毒血清8b型，可在24min钟就开始进入指数增长期，敏感性更高，特异性强，检测速度快，反应结果肉眼可识别。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及一种鉴定禽腺病毒的方法，尤其是一种LAMP可视化鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法。

背景技术

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAdV-Ⅰ)属于腺病毒科禽腺病毒属，Ⅱ亚群(火鸡出血性肠炎和相关病毒)和Ⅲ亚群(产蛋下降综合征)病毒和疾病的相关性明确。相比之下，大多数的Ⅰ亚群腺病毒对禽类的致病作用还未完全确定，不同的血清型,甚至相同血清型的不同毒株,在造成发病和死亡/或者引发呼吸道疾病的能力也有所不同。根据FAdV-Ⅰ的核酸序列特征和血清交叉中和试验结果，将FAdV-Ⅰ分为5个种群(FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E)和12个血清型(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)。近年来国内多个研究报道显示，FAdV-Ⅰ广泛存在于鸡、鸭、鹅等多种禽类的呼吸道和消化道中，目前我国鸡群流行的优势毒株血清型为血清4型(FAdV-4)、血清8型(FAdV-8，包含禽腺病毒8a型(Fowl adenovirusgroup 8a,FAdV-8a)和禽腺病毒8b型(Fowl adenovirus group 8b,FAdV-8b))和FAdV-11。其中，禽腺病毒血清8型(FAdV-8)在鸡群较为流行,主要引起鸡的包涵体肝炎，常见于3～8周龄的鸡，主要感染肉仔鸡及育雏、育成阶段的蛋鸡或种鸡，总体死亡率通常在10％以下，有时可达到30％，近年来,这种疾病在我国的发病率呈上升趋势,对养鸡业造成了很大的经济损失。

目前针对FAdV-8的诊断检测方法常常采用2种方法：第一种是分子生物学方法，包括荧光定量PCR方法、DNA序列测定技术、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,但是需要依赖专门的仪器，成本较高；第二种是血清学诊断方法，如琼脂扩散试验实验，虽然不依赖于昂贵的仪器，但是耗时较长，不能快速、及时地对FAdV-8的检测结果作出判断。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,以下简称LAMP)技术是反应混合物在等温(60-65℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，但目前还没有关于LAMP快速鉴定FAdV-8的产品和方法的相关报道。

发明内容

本申请的发明人经过大量的研究(其中，设计了4套引物组，只筛选到本发明所述能特异性扩增阳性FAdV-8a和FAdV-8b DNA的LAMP的引物组，其余3套引物无论如何优化反应条件，均未出现扩增)后，出人意料地发现了特别适用于鉴定禽腺病毒血清8型的方法。基于此，本发明成功地建立了用于鉴定禽腺病毒血清8型的引物组、试剂盒以及鉴定方法平台，用于确定待测样品中是否含有禽腺病毒血清8型的方法，该方法重复性好，特异性强，灵敏度高。

本发明的目的在于提供一种鉴定I群禽腺病毒血清8型的LAMP的方法。

为达到上述目的，本发明要求保护一种用于鉴定I群禽腺病毒血清8型的引物组，包括外引物、内引物和环引物；

所述外引物包括FAdV-8-F3和FAdV-8-B3，其中

所述外引物FAdV-8-F3为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)SEQ ID No.1所示的序列；