[发明专利]一种菰米遗传转化体系建立的方法

权利要求书

1.一种菰米遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；愈伤组织诱导培养的条件为：光培养，光强4000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，温度25-35，℃培养3周后，得胚性愈伤组织；

所述愈伤诱导培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素，100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D，1mg/mL，2mL；蔗糖30g；植物凝胶3g；

2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2-0.4的农杆菌菌液；

所述农杆菌活化培养基的配方为：每升培养基含酵母提取物10g；蛋白胨10g；NaCl50g；卡那霉素，50mg/mL，1mL；利福平，10mg/mL，1.5mL；乙酰丁香酮，20mg/mL，1mL；琼脂12g；

农杆菌重悬液的配方为：每升含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；B5维生素，100X10mL；铁盐100X10mL；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.5g；2,4-D，1mg/mL 2mL；蔗糖20g；葡萄糖10g；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL；

3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15-25min；

4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15-25mg/L的乙酰丁香酮的农杆菌重悬液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20-28℃黑暗培养2-4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25-35℃光照培养3-6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；

所述恢复培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D，1mg/ml，2mL；羧苄青霉素，250mg/mL，1mL；蔗糖30g；植物凝胶3g；

所述筛选培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；蔗糖30g；2,4-D，1mg/mL，2mL；羧苄青霉素，250mg/mL，1mL；Hyg-B，50mg/mL，1.4mL；植物凝胶3g；

5)愈伤组织再生：将4)所得愈伤颗粒在培养基上筛选3-4周之后，转至再生培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；苗生长至长度2-5cm，移至生根培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；

所述再生培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；CuSO4，5mg/mL，0.5mL；MES 0.5g；水解酪蛋白1g；蔗糖30g；山梨醇30g；羧苄青霉素，250mg/mL，0.5mL；Hyg-B，50mg/mL，0.4mL；NAA，1mg/mL，0.5mL；6-BA，1mg/mL，0.5mL；TDZ，1mg/mL，1mL；氨基酸10X 100mL；植物凝胶2.8g；

所述生根培养基的配方为：每升培养基含MS盐2.165g；B5维生素，100X10mL；蔗糖20g；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，0.5mL；NAA终浓度1mg/mL，0.4mL；植物凝胶3.5g；

恢复培养、筛选培养、再生培养及生根培养的条件为：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。