[发明专利]一种菰米遗传转化体系建立的方法

说明书

本发明属于植物基因工程领域。受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。本发明一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种菰米遗传转化体系建立的方法。

背景技术

中国菰(Zizania latifolia)起源于中国，分布于日本、韩国、印度和东南亚中南半岛国家。除西藏外，中国各地尤其是长江流域的河流、湖泊、沟渠、池塘、稻田周围中都有中国菰的分布。菰米(wild rice)是中国菰的颖果，它在我国作为粮食食用已经有3 000多年的历史，在古代是供帝王食用的重要的“六谷”(稻、黍、稷、粱、麦、菰)之一。唐代之后，随着人口数量的大幅度增长、围湖造田等各种农事活动增多，以及水稻种植技术的推广，再加上菰米采收和脱壳较为困难，菰米渐渐淡出人们的视线。随后，菰米逐渐作为中药材使用，明代李时珍《本草纲目》等著作有将菰米用于治疗消渴症(糖尿病)和胃肠疾病的记载。菰米由于较高的营养价值以及独特的风味，开始广泛出现在餐桌、商店里，受到越来越多人的欢迎。

目前，中国菰的生物活性和保健作用已被中国和韩国等东亚科学家广泛关注。菰米已经证实的生物活性和保健价值包括抗氧化活性、改善胰岛素抵抗、改善脂质毒性以及预防心血管疾病等。菰属植物营养成分的研究主要集中在其种子即菰米当中，菰米不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，而且含有大量的抗性淀粉、膳食纤维、植物甾醇、花青素和原花青素等生物活性物质。与北美菰米相比，中国菰米的长度和直径更小。与大米相比，菰米是一种高蛋白、低脂的健康食品。

菰米自身也有一些局限性，比如含有落粒基因，导致成熟的种子容易落粒等特征，不适用于大规模生产应用。因此，对于菰米相关基因的功能研究显得尤其重要，对于菰米的基因工程相关的技术和研究急待突破。然而，一直受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。

发明内容

针对目前农杆菌介导的菰米遗传转化体系尚未建立的上述问题，本发明提供一种菰米遗传转化体系建立的方法。本发明中，一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。

本发明是这样实现的，菰米遗传转化体系建立的方法，包括以下步骤：

1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；

2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2-0.4的农杆菌菌液；

3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15-25min；

4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15-25mg/L的乙酰丁香酮的农杆菌重悬液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20-28℃黑暗培养2-4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25-35℃光照培养3-6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；