[发明专利]一种AFB1

说明书

本发明公开了一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法，其步骤是：1)配制含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养基中含有青霉素和链霉素；2)将黄曲霉毒素B₁溶解于二甲基亚砜溶液中，并用步骤1)中所述的培养基稀释，得到诱导液，诱导液中黄曲霉毒素B₁终浓度为0.05～0.25μg/mL，二甲基亚砜终浓度为0.01～0.025％；3)培养鸡肝癌细胞系至长势良好且状态稳定；4)当鸡肝癌细胞系生长至贴壁70～80％时，加入步骤2)中所述诱导液，诱导培养6～24h，即得。

技术领域

本发明属于细胞模型建立领域，尤其涉及一种黄曲霉毒素B₁ (AFB₁)诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法。

背景技术

据联合国粮农组织(FAO)调查表明，全世界约25％以上的谷物受到霉菌毒素(Mycotoxins)的污染，其中，以黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF)的污染最为严重。据中国饲料原料调查研究表明，我国玉米中 AF的污染比例高达84％。AF是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，目前已发现的AF约20种，其中，AFB₁因毒性最强、危害最大、分布最广而被列入一级致癌物。同时，AFB₁也是最有潜力的细胞毒性物质，它进入机体产生活性氧簇(ROS)从而引起氧化应激反应，造成慢性或急性中毒，最终导致器官损伤。据报道，AFB₁对动物具有肝毒性、遗传毒性和免疫毒性作用，其中，家禽对AFB₁高度易感。用AFB₁污染的饲料饲喂家禽会导致急性肝损伤、生产性能下降和抗病能力降低，甚至死亡，给养禽业带来巨大的经济损失。

作为动物的解毒器官，肝脏是AFB₁作用的主要靶器官。虽然动物本身对AFB₁具有一定的解毒代谢能力，但幼龄动物器官发育不完全，长时间的摄入AFB₁会刺激肝细胞产生大量ROS和促进肝细胞凋亡，从而影响幼龄动物肝脏的发育和正常功能，严重危害动物健康生产。

细胞是体外试验和分子机制研究的重要模型，对寻找防治AFB₁诱导鸡肝脏损伤的作用靶点具有重要作用。目前常被用来构建肝细胞损伤模型的细胞多为鸡的原代肝细胞，然而鸡的原代肝细胞在应用过程中存在分离培养过程复杂，细胞状态不稳定等缺点。现有技术中缺乏一种操作简便且效果稳定的AFB₁诱导的鸡肝细胞损伤模型，严重制约了AFB₁诱导鸡肝脏损伤的体外分子机制研究和防治药物筛选。鸡肝癌细胞系(LMH)是由一位日本学者在1981年所建立，生长特性为贴壁，形态特性为上皮细胞样。LMH生长较为迅速且易于培养，存活率高，活性好。因此，本发明以LMH为模型细胞，通过观察不同质量浓度的AFB₁对LMH的存活率和凋亡比例的作用，评估AFB₁诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法，可为进一步研究AFB₁诱导鸡肝细胞损伤的作用机制奠定基础，也为生产中防治AFB₁对鸡肝脏损伤研究提供体外试验模型。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明是一种AFB₁诱导鸡肝脏损伤的细胞模型建立方法，旨在构建操作简单且效果稳定的鸡肝细胞损伤模型，为AFB₁诱导鸡肝脏损伤的防治研究提供试验模型。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种鸡肝脏损伤的细胞模型得建立方法，其步骤是：1)配制完全培养基；2)将AFB₁溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并用完全培养基稀释，得到诱导液； 3)培养鸡肝癌细胞系；4)将诱导液加入培养好的鸡肝癌细胞系中，即得。

优选的，完全培养基为含有终浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12 培养基。

优选的，诱导液中所述AFB₁的终浓度为0.05-0.25μg/mL。