[发明专利]一种能显著增强杀伤活性的NK细胞扩增方法

说明书

本发明提供了一种能显著增强杀伤活性的NK细胞扩增方法，包括以下步骤：(1)构建含有NK扩增所需的细胞因子基因且带有哺乳动物启动子的重组杆状病毒；(2)利用步骤(1)制备的重组杆状病毒对MSC细胞进行感染；(3)将步骤(2)中感染后的MSC细胞加入已活化培养的NK细胞中共培养,共培养24‑60小时后，NK细胞再继续传代扩增培养。本发明扩增方法既能显著增强NK细胞杀伤活性又能大大提升扩增倍数，并且整个方法过程满足GMP要求同时也符合临床使用标准。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种能显著增强杀伤活性的NK细胞扩增方法。

背景技术

NK细胞称自然杀伤细胞(Natural kill cell)是人体先天性免疫系统的重要组成部分,细胞表型特征CD3-CD56+，NK细胞发挥杀伤靶细作用时无需抗原预先致敏，也无MHC限制。而且NK细胞CD56分子表达的密度的差异，将NK分为CD56dim和CD56bright两个亚群，CD56dim占NK细胞的90％以上，主要为细胞毒作用，具有很强的杀伤活性；CD56bright可产生大量细胞因子，主要起免疫调节作用。

NK不同于T细胞和B细胞，缺少基因重排，不像T细胞、B细胞一样通过特异性TCR识别靶细胞，而是通过胚系基因表达的受体识别靶细胞。NK细胞受细胞表面多种受体调控：杀伤细胞活化受体(KAR)和杀伤细胞抑制受体(KIR)。正常情况下，KAR与自身细胞上多糖类抗原结合产生活化信号，同时KIR与MHCI类分子结合，产生抑制信号且占主导地位，以保证自身组织细胞不被破坏；当细胞表面MHCI类分子发生改变或减少缺失，影响与KIR结合，不能产生抑制性信号，NK则活化，产生杀伤效应。NK细胞的杀伤机理有：释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒，裂解肿瘤细胞；活化NK细胞表达Fas(CD95)配体和TRAIL(TNF relatedapoptosis inducing ligand)分子，诱导靶细胞进入程序死亡；NK分泌多种细胞因子介导杀伤作用；在肿瘤或病毒特异性IgG抗体存在条件下，NK细胞也可通过表面IgGFC(FCrRⅢ)介导产生ADCC效应。

人们经研究认为：NK细胞的动物实验及临床研究报告显示，NK对多种肿瘤杀伤的有效性，目前国内有200多家研究所与企业涉及NK细胞的项目研究与临床试验；在美国NK细胞临床试验研究多达800多项，目前单就NIH注册的NK细胞治疗淋巴瘤临床试验超过20余项，部分使用细胞多来源于脐血或患者家属等。

目前NK细胞规模化制备存在以下产业化瓶颈：

1、添加可溶性重组生长因子、IL-2、IL-15等常规NK细胞培养方法，存在扩增倍数有限且杀伤活性不高的缺点。

2、利用K562作为NK细胞扩增培养时的滋养层细胞(K562IL15-4-IBBligand)经伽马辐射后使用，不符合GMP标准包括安全性责疑。

因此，本领域技术人员一直致力于研究一种既能增强NK细胞杀伤活性又能大大提升扩增倍数并且能符合GMP标准和临床使用标准要求的NK细胞扩增方法。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种能显著增强杀伤活性的NK细胞扩增方法，既能显著增强NK细胞杀伤活性又能大大提升扩增倍数，并且整个方法过程满足GMP要求同时也符合临床使用标准。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供了一种能显著增强杀伤活性的NK细胞扩增方法，包括以下步骤：

(1)构建含有NK扩增所需的细胞因子基因且带有哺乳动物启动子的重组杆状病毒；

(2)利用步骤(1)制备的重组杆状病毒对MSC细胞进行感染；

(3)将步骤(2)中感染后的MSC细胞加入已活化培养的NK细胞中共培养,共培养24-60小时后，NK细胞再继续传代扩增培养；