[发明专利]北柴胡非皂苷类成分HPLC指纹图谱的构建方法及应用

权利要求书

1.一种北柴胡非皂苷类成分HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：称取柴胡皂苷b2对照品，加甲醇制成质量浓度为0.1-0.7 g·L^-1的对照品溶液，4℃保存备用；

（2）北柴胡供试品溶液的制备：取0.5-5.0g柴胡细粉精密称定，放入锥形瓶中，精密量取甲醇5-50 mL，加入锥形瓶中，用封口膜密封，并对它进行称重，超声处理 30 -60min，在室温中放冷后，再次称重，补足失重，取上清液在高速冷冻离心机中在室温下以8000r/min离心10分钟，取上清液，过 0.22 μm微孔滤膜，既得供试品溶液；

（3）色谱检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱温为20-40 ℃，流速为0.6-1.5 ml/min，检测波长为210-280 nm，流动相为0.03-0.3%甲酸乙腈和0.03-0.3 %甲酸水条件下梯度洗脱；

（4）测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的北柴胡非皂苷类成分HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于所述梯度洗脱条件为：流动相为0.1%甲酸乙腈和0.1 %甲酸水，

0~30min，0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水体积比由10%﹕90%到40%﹕60%；

30~55min，0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水体积为40%﹕60%到75%﹕25%；

55~67min，0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水体积比由75%﹕25%到95%﹕5%；

67~70min，0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水体积比为95%﹕5%到95%﹕5%。

3.根据权利要求1所述的北柴胡非皂苷类成分HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所得指纹图谱，包括11个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为：

（1）16.014min：槲皮素；

（2）17.392min：异绿原酸A；

（3）21.101min：6,7-Diethoxy-4-methylcoumarin；

（4）23.624min：Prenyletin；

（5）37.807min：柴胡皂苷b2；

（6）44.355min：Busaliol；

（7）54.918min：RB3；

（8）58.552 min：葛根素；

（9）59.119min：RB4；

（10）65.340min：RB6；

（11）66.393 min：Hexadecanoic acid。

4.一种权利要求1~3任一项所述方法构建的北柴胡非皂苷类成分HPLC指纹图谱在产品鉴别中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将收集到的柴胡依据不同产地、不同品种、不同种植方式进行划分，并通过比较色谱图，找出相同产地、相同品种、相同种植方式，将这些峰的峰面积进行归一化处理后，将数据导入到SIMICA-P 13.0进行差异分析；对产地的柴胡数据进行OPLS-DA 分析，结合VIP值确定两者之间的差异化学成分，并采用ROC曲线对差异成分进行预测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所得三维数据表导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析构建模型，获取模型参数以及样本在多位数学模型中的分布情况，包括：

采用正交偏小二乘判别分析OPLS-DA多维投影分析的数据处理方法能够观察到各个样本在多维空间模型中的相对位置信息，以位置信息反映复杂的代谢谱信息；采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP值，阈值1，并结合学生氏t检验的p值，阈值0.05，最终确定具有差异性的化合物，并将具有差异的化合物作为预测因子，以不同产地进行分组，进行受试者工作特征曲线ROC曲线的绘制，并计算曲线下峰面积。