[发明专利]一种蛋白质赖氨酸位点的修饰方法及其应用

说明书

本发明提供了一种蛋白质赖氨酸位点的修饰方法，步骤如下：蛋白和探针于PBS中混匀，于37℃水浴中反应后，加入适量的聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液混匀，沸水加热10分钟，进行分离，通过考马斯亮蓝染色进行染色鉴定，通过免疫印迹实验检测对应蛋白的含量，用以鉴定蛋白质的生物素等特定修饰；探针为具有锍盐活性酯结构的探针。本发明拓展了对锍盐的蛋白质修饰方法，实现了对于蛋白质赖氨酸位点的偶联修饰。本发明还开发了一种新型抗体偶联药物，针对目标蛋白赖氨酸进行修饰，实现了利用新型锍盐链接结构的抗体偶联药物的构建。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质特定位点的修饰方法及其用途，属于化学生物学与生物技术领域，尤其涉及利用炔丙基锍盐修饰蛋白质赖氨酸位点的方法及其应用。

背景技术

在过去的二十年中，科学家们已经开发了许多化学修饰靶蛋白的策略，包括位点选择性和化学选择性方法。无论是在体外还是在细胞中，由于蛋白质与细胞环境的复杂性，蛋白质修饰仍然存在选择性差、反应条件相对苛刻、反应速度慢、反应活性与选择性两难等问题。实现位点选择性的一种方法是利用生物正交反应对整合了非天然氨基酸的蛋白质进行标记，以及对整合特定多肽序列的蛋白进行空间识别，实现位点选择性的另一种方法是配体诱导的蛋白质偶联。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白质赖氨酸位点的修饰方法。

本发明提供了一种蛋白质赖氨酸位点的修饰方法，步骤如下：蛋白和探针于PBS中混匀，于37℃水浴中反应后，加入聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液混匀，加热8-10分钟，进行SDS-PAGE凝胶分离，通过考马斯亮蓝染色可以进行染色鉴定，通过免疫印迹实验可以检测对应蛋白的含量，用以鉴定蛋白质的生物素等特定修饰；

其中，探针为锍盐活性酯探针，结构式如下：

其中，R为生物素基团、荧光基团或生物功能基团。

本发明中，分离后通过考马斯亮蓝染色进行染色鉴定。

本发明中，分离后通过免疫印迹实验检测对应蛋白的含量。

本发明中，探针为锍盐活性酯探针2，结构式如下：

本发明中，锍盐活性酯探针2的制备方法为：将生物素溶解在甲醇中，加入摩尔比1：2的二甲基(丙-2-炔-1-基)锍盐和N，N-二甲基甲酰胺，在37℃下反应6小时，减压浓缩，通过HPLC纯化和分离，反应式如下：

本发明中，探针还可以为锍盐活性酯荧光探针4，结构式如下：

本发明中，锍盐活性酯荧光探针4的制备方法为：将磺基青色素5(Cy5)溶解在甲醇中，加入二甲基(丙-2-炔-1-基)锍盐和N，N-二甲基甲酰胺，在37℃下反应6小时，减压浓缩，通过HPLC纯化和分离。

本发明还提出具有锍盐活性酯结构的探针在制备抗体偶联药物中的应用：探针与蛋白以摩尔比1：10，pH为7.4，在37℃下反应12小时，反应后通过分子筛在快速蛋白质液相色谱(FPLC)上纯化，

其中，探针为锍盐活性酯探针5，结构如下：

本发明中，锍盐活性酯探针5的制备步骤如下：选择细胞毒性药物一甲基澳瑞他汀E(MMAE)作为细胞毒药，将一甲基澳瑞他汀E的非活性末端进行修饰，形成末端羧基的结构，与二甲基的炔丙基硫盐反应，HPLC分离纯化后得到锍盐活性酯探针5。