[发明专利]一种甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法及应用

权利要求书

1.一种用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的CRISPR/Cas9系统序列元件组，其特征在于，所述序列元件组包括U6-26p-Target1-gRNA、U6-26p-Target2-gRNA和密码子优化后的Cas9基因；所述U6-26p-Target1-gRNA包括启动子U6-26p，gRNA骨架结构和Target1；所述U6-26p-Target2-gRNA包括启动子U6-26p，gRNA骨架结构，Target2；

其中，所述甘蓝型油菜BnHBBD基因包括BnHBBD-C06和BnHBBD-A07，所述Target1为基因BnHBBD-C06的靶点序列，所述Target2为基因BnHBBD-A07的靶点序列。

2.根据权利要求1所述的用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的CRISPR/Cas9系统序列元件组，其特征在于，所述Target1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述Target2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的CRISPR/Cas9系统序列元件组，其特征在于，

BnHBBD-C06的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

BnHBBD-A07的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。

4.一种基因编辑载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR，其特征在于，所述基因编辑载体包含权利要求1～3任一项所述的用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的CRISPR/Cas9系统序列元件组。

5.一种用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌采用权利要求4所述的基因编辑载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR转化宿主细菌得到。

6.一种用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的基因编辑载体或权利要求5所述的基因工程菌。

7.权利要求1-3任一所述的序列元件组、权利要求4所述的基因编辑载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR、权利要求5所述的基因工程菌或权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用包括：

A)在甘蓝型油菜基因BnHBBD-C06和/或基因BnHBBD-A07定点突变中的应用，所述BnHBBD-C06基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，所述BnHBBD-A07基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；

B)在具有长开花期的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或

C)在具有抗菌核病的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或

D)在具有角果不易开裂的甘蓝型油菜育种中的应用。

8.一种利用CIRSPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法，其特征在于，包括：

(1)针对甘蓝型油菜中的BnHBBD基因设计筛选靶点Target1和Target2，并设计sgRNA序列，将2个靶点Target1和Target2分别与sgRNA序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR；

(2)将基因编辑载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR转化农杆菌GV3101，得到含有基因编辑表达载体pKSE401-BnHBBD-CRISPR的农杆菌；

(3)扩大培养，利用得到的农杆菌菌液介导油菜下胚轴转化；

(4)油菜下胚轴培养、诱导愈伤组织、再分化、生根培养、炼苗、移栽，得到转基因油菜；

(5)鉴定获得BnHBBD基因发生突变的转基因植株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜BnHBBD基因包括BnHBBD-C06和BnHBBD-A07，所述Target1为基因BnHBBD-C06的靶点序列，所述-Target2为基因BnHBBD-A07的靶点序列，

所述Target1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，

所述Target2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，

所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，

所述BnHBBD-C06的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，

所述BnHBBD-A07的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。