[发明专利]一种甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法及应用

说明书

本发明提供了一种甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法及应用，属于植物基因编辑和植物育种技术领域；在本发明中，针对甘蓝型油菜中的BnHBBD基因设计筛选靶点Target1和Target2，并设计sgRNA序列，然后将2个靶点分别与2个相同的sgRNA序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pKSE401‑BnHBBD‑CRISPR，转化甘蓝型油菜，实现对甘蓝型油菜BnHBBD基因的定点突变，通过自交来分离载体所携带的外源基因得到具有长开花期、抗菌核病和角果不易开裂的非转基因油菜新材料；本发明利用基因编辑技术在甘蓝型油菜中进行编辑，极大的缩短了新种质的获得周期，为油菜育种提供创新种质。

技术领域

本发明属于植物基因编辑和植物育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnHBBD基因 定点突变的方法及应用。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)是我国种植最广泛的油料作物之一，它不仅可以用来生产食用油， 也可用来观赏，是我国重要的经济作物之一。生物育种和种子工程发展迅速，目前，我国的 育种手段和技术更加注重生物育种，并即将对农业生物种质资源挖掘与创新利用设立重点专 项，增强创新能力，提高自主研发水平。

在现代社会，随着人们生活水平的提高，加之油菜花颜色鲜艳、花色多、分布广泛、管 理简单、投入较低，很自然的就成为了极具观赏价值的农田景观作物，油菜旅游业逐渐愈发 火热。最为出名的江苏兴化的垛田油菜花景区和青海门源的油菜花海景区，仅一天的门票收 入就有近百万，综合旅游收入数十亿(数据来源江苏省人民政府、门源县人民政府)。

基因编辑(Gene Editing)，是一种新兴、精确的能对生物体基因组特定基因进行修饰的 基因工程技术。近年来，有研究利用基因编辑技术将大豆中LNK2基因的敲除影响了大豆的 开花时间，还有研究利用CRISPR/Cas9系统获得水稻突变体，发现丙酮酸酶和细胞周期蛋白 的表达之间的关系，提高了籽粒产量；研究还发现通过多重gRNA和单gRNA敲除油菜中异 源四倍体的多个溶血磷脂酸酰基转移酶LPAT(Lysophosphatidic acidacyltransferase)基因会引 起脂肪酸含量变化。目前，CRISPR/Cas9系统定点突变技术已经逐步成熟，可以极大缩短新 种质的获得周期。

目前，油菜在自然环境下生长开花时，油菜的各个部位可能会被传播核盘菌子囊孢子。 在油菜的各个部位中，凋落的花瓣带菌率最高，且菌丝会随着花瓣的脱落飘落到茎和叶片上， 对油菜进行再次侵染，进而造成大面积菌核病发病。除此之外，油菜还存在着角果易开裂， 机械化收割造成菜籽损耗大、收割效率不高、适宜观赏花期短等问题。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法 及应用。在本发明中，利用CIRSPR/Cas9系统对甘蓝型油菜的BnHBBD基因定点突变来育种， 获得了一种具有长开花期、抗菌核病和角果不易开裂的转基因植株。其中，基因BnHBBD名 中，Bn表示油菜英文简写，H、B、B、D分别为花(Hua)、瓣(Ban)、不(Bu)、掉(Diao)的汉语拼音首字母。

本发明中，首先提供了一种用于甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的CRISPR/Cas9系统 序列元件组，其特征在于，所述序列元件组包括U6-26p-Target1-gRNA、U6-26p-Target2-gRNA 和根据密码子优化后的Cas9基因；所述U6-26p-Target1-gRNA包括启动子U6-26p，gRNA骨 架结构和Target1；所述U6-26p-Target2-gRNA包括启动子U6-26p，gRNA骨架结构，Target2；

其中，所述甘蓝型油菜BnHBBD基因包括BnHBBD-C06和BnHBBD-A07，所述Target1为基因BnHBBD-C06的靶点序列，所述-Target2为基因BnHBBD-A07的靶点序列。

其中，所述Target1的核苷酸序列为：5’-TACGATGGTTCTGCTCTGTC-3’(SEQ.ID.NO.1)；