[发明专利]基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法

说明书

本发明提供一种基于液相色谱‑质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，属于单克隆抗体检测技术领域，其利用商品化的稳定同位素标记的通用单克隆抗体作为内标，并采用琼脂糖基质磁性微球实现人血清样品中的特瑞普利单抗的富集，酶解获得特征性肽段，通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单抗的含量，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强的优点。

技术领域

本发明属于单克隆抗体检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法。

背景技术

单克隆抗体药物发展迅速，在肿瘤、免疫、血液等系统疾病领域应用日益广泛。单克隆抗体药物作为一种大分子蛋白，在生物体内的处置具有特殊性和复杂性，极大地增加了生物检测的难度，因此必须建立专属、灵敏、准确、可重复的测定分析方法。

特瑞普利单抗(toripalimab,JS001，商品名拓益)是上海君实生物医药科技有限公司自主研发的首个获批上市的国产PD-1抑制剂，作为国内自主研发的创新药，在多种恶性肿瘤中显示出显著的疗效。根据相关报道，多剂量输注时观察到特瑞普利在体内的积累，血清药物谷浓度在大约连续5次给药后稳定下来；分别给予特瑞普利单抗1、3和10mg/kg后，其稳态谷浓度分别为(8.9±4.4)、(37.8±17.5)和(174.3±95.6)μg/mL。

目前，单抗药物常用的分析手段有免疫分析法和液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)等。免疫分析法为单抗药物分析的主流方法，其灵敏度可达ng级别，但其动态范围有限，易受内源或外源物质干扰，对样品的质量依赖性较强，影响定量的可靠性。同传统的免疫学相比，LC-MS/MS具有线性动态范围宽、抗干扰能力强、灵敏度高、准确度高、可进行多组分同时分析等优点，2020中国药理学会和中日友好医院共同发起并制定《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识(2020版》，并推荐建立LC-MS/MS法测定单抗等生物类似药的血药浓度，制订适合患者的个体化给药方案，实现个体化药物治疗。但目前却未见有相关LC-MS/MS法测定特瑞普利单抗血药浓度方法的报道。

发明内容

基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，利用商品化的稳定同位素标记的通用单克隆抗体作为内标，并采用琼脂糖基质磁性微球实现人血清样品中的特瑞普利单抗的富集，酶解获得特征性肽段，通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单抗的含量，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强的优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，使用同位素标记的单克隆抗体作为内标，先采用琼脂糖基质磁性微球富集人血清样品中的特瑞普利单克隆抗体，再酶解富集后的单克隆抗体以获得特征性肽段，最后使用液相色谱-质谱检测平台通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单克隆抗体的含量。

根据以上方案，所述的基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法包括以下详细步骤：

步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；

步骤S2，按校准品溶液、质控品溶液、空白血清和待测样本的总数量分别取磁珠悬浮液并使用磷酸缓冲盐溶液清洗，并去掉清洗液；

步骤S3，分别向对应的磁珠中添加空白血清、系列浓度的校准品溶液、质控品溶液及待测样本，再加入内标工作液和磷酸缓冲盐溶液，室温孵育25-35min，孵育完成后使用磷酸缓冲盐溶液清洗孵育完的磁珠，去掉清洗液并分别收集磁珠；

步骤S4，往步骤S3中收集到的磁珠中加入碳酸氢铵溶液，95℃，反应5.0min；

步骤S5，再往步骤S4中的混合物中加入二硫苏糖醇溶液，100.0℃反应10.0min；