[发明专利]一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β‑丙氨酸的方法，属于生物工程领域。本发明构建了一种工程菌株，通过游离型表达质粒分别过表达panD基因、aspA基因、大肠杆菌来源的ppc基因、gldA基因和dhaKLM基因，敲除了染色体上的lacI基因、乙醛羧酸循环抑制子iclR和富马酸消耗途径的fumA和fumC基因获得高效生产β‑丙氨酸的重组菌。该重组菌株能够以廉价的甘油为底物，发酵生成附加值更高的β‑丙氨酸，发酵50h，β‑丙氨酸产量可达37.9g/L，为工业绿色、高效生产β‑丙氨酸提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术

β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸，已被广泛应用于精细化工、医药、食品、饲料等多个领域，在人们的日常生活及生产过程中发挥着越来越重要的作用。目前工业合成β-丙氨酸的主要方法是化学合成法，该方法能耗较高，对设备要求严苛。微生物发酵法反应条件温和，可以实现β-丙氨酸的绿色生产。但是发酵法高效生产β-丙氨酸的研究较少，尚未建立成熟的生产体系，限制了该方法在工业生产上的大范围推广。

Song等（Metabolic engineering of Escherichia colifor the production of3-aminopropionic acid.Metabolic Engineering.2015,30:121-129）以大肠杆菌为底盘菌株，构建微生物细胞工厂，以期通过好氧发酵过程高效生产β-丙氨酸。通过对底盘菌株的多轮改造，最终产量达到32.3 g·L^-1，为目前已知最高产量。但是，该研究尚未完全成熟，依旧限制了该方法在工业应用上的推广。如该研究所构建工程菌株并未敲除有机酸等副产物的合成途径，副产物的积累会影响菌体的生长，而且会降低底物转化率，同时降低产物的化学纯度。而且该研究构建工程菌株的过程并未全局性调控大肠杆菌胞内代谢途径，导致代谢失衡，以至于β-丙氨酸的产量未随着代谢途径的叠加改造而逐步增加。

发明内容

针对现有的重组大肠杆菌生产β-丙氨酸产量较低的问题，本发明提供了一株产β-丙氨酸的重组大肠杆菌，通过在大肠杆菌中构建新的代谢途径，使重组大肠杆菌能够以甘油作为合成β-丙氨酸的原料，转化低价值的原料为高附加值化学品。

本研究根据好氧发酵过程中大肠杆菌合成β-丙氨酸的代谢途径（图2），将β-丙氨酸的从头合成途径划分为三大模块，并分别命名为β-丙氨酸合成模块（模块一）、TCA模块（模块二）和底物酵解模块（模块三），并利用模块化的调控策略对三大模块内及模块间的代谢流进行全局而系统的调控。

本发明的目的是提供一种高效合成β-丙氨酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达了天冬氨酸-α-脱羧酶、天冬氨酸氨裂解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油脱氢酶和/或二羟丙酮激酶，并敲除了乳糖操纵子阻遏蛋白、乙醛羧酸循环抑制子、延胡索酸酶。

在一种实施方式中，天冬氨酸-α-脱羧酶序列的GenBank: QYO72381.1或NCBIReference Sequence: NP_001096055.1；天冬氨酸氨裂解酶序列的NCBI ReferenceSequence: NP_418562.4。

在一种实施方式中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶序列的NCBI Reference Sequence:NP_418391.1；甘油脱氢酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_418380.4；二羟丙酮激酶序列的NCBI Reference Sequence: NP_415718.6、NP_415717.1、NP_415716.4。