[发明专利]一种单碱基延伸引物组及维生素A代谢相关基因多态性的检测方法

权利要求书

1.一种维生素A代谢相关基因多态性的非诊断检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别设计多重PCR扩增引物组和单碱基延伸引物组，备用；

提取待测样本基因组DNA，备用；

所述单碱基延伸引物组包括以下单碱基延伸引物：

用于维生素A代谢相关的BCO1基因的单碱基延伸的引物EP-1、引物EP-2、引物EP-3、引物EP-4、引物EP-5、引物EP-6和引物EP-7，引物EP-1、引物EP-2、引物EP-3、引物EP-4、引物EP-5、引物EP-6和引物EP-7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-7所示；

用于维生素A代谢相关的RBP4基因的单碱基延伸的引物EP-8、引物EP-9、引物EP-10和引物EP-11，引物EP-8、引物EP-9、引物EP-10和引物EP-11的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.8-11所示；

用于维生素A代谢相关的FFAR4基因的单碱基延伸的引物EP-12，引物EP-12的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

用于维生素A代谢相关的PKD1L2基因的单碱基延伸的引物EP-13，引物EP-13的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

用于维生素A代谢相关的PNPLA3基因的单碱基延伸的引物EP-14，引物EP-14的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

用于维生素A代谢相关的TTR基因的单碱基延伸的引物EP-15，引物EP-15的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

S2、配制多重PCR扩增体系：所述多重PCR扩增体系包括待测样本基因组DNA和所述多重PCR扩增引物组；以所述待测样本基因组DNA为模板，并加入所述多重PCR扩增引物组，扩增得到多重PCR扩增产物；

S3、配制酶消化反应体系：所述酶消化反应体系包括所述多重PCR扩增产物和碱性磷酸酶；所述多重PCR扩增产物经碱性磷酸酶消化后得到酶消化产物；

S4、配制单碱基延伸反应体系：所述单碱基延伸反应体系包括所述酶消化产物和所述单碱基延伸引物组；以所述酶消化产物为模板，加入所述单碱基延伸引物组后进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸产物；

S5、将所述单碱基延伸产物纯化后进行质谱检测，获得待测标本的维生素A代谢相关基因位点的多态性；步骤S5中对纯化后的所述单碱基延伸产物采用液相-质谱联用进行检测；进行液相分离时选用C18反相色谱柱，柱温42~75℃，色谱柱的流动相由水相A和有机相B组成，所述水相A为含有0.5~5Vol.%六氟异丙醇和0.05~0.5Vol.%三乙胺的水溶液，所述有机相B为含有0.5~5Vol.%六氟异丙醇和0.05~0.5Vol.%三乙胺的甲醇溶液；

采用梯度洗脱方式，洗脱程序为：在0min时，有机相B为2%~8%；在0~(2~3.5)min时，有机相B由2%~8%连续匀速变化至45%~75%；在(2~3.5)~(4.5~5.5)min时，有机相B由45%~75%连续匀速变化至85%~98%；(4.5~5.5)~(6~7.5)min时，有机相B由85%~98%连续匀速变化至2%~8%；(6~7.5)~(8~15)min，维持有机相B为2%~8%，梯度洗脱总时间为8~15min，流动相的流速为0.1~0.5mL/min；

或者采用梯度洗脱方式，洗脱程序为：在0min时，有机相B为2%~8%；在0~(1.0~2.5)min时，有机相B由2%~8%连续匀速变化至45%~75%；在(1.0~2.5)~(2.6~3.5)min时，有机相B由45%~75%连续匀速变化至85%~98%；(2.6~3.5)~(3.6~4.5)min时，有机相B由85%~98%连续匀速变化至2%~8%；(3.6~4.5)~(5~10)min，维持有机相B为2%~8%，梯度洗脱总时间为5~10min，流动相的流速为0.1~0.5mL/min。