[发明专利]用于检测松材线虫的crRNA及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测松材线虫的crRNA，包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1~2中的至少一种，其能够杂交至靶RNA序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。本发明还公开了一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的crRNA或可转录为所述crRNA的DNA。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测松材线虫的crRNA及试剂盒。

背景技术

松材线虫病又称松树萎蔫病，是全球森林生态系统中最具危险性和破坏性的森林病害。其病原物松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)对松木造成毁灭性打击，是国际上公认的检疫性有害生物，尽管其危害严重，目前仍没有有效的防治方法。而对松材线虫的检测有利于及时发现早期疫点，有效控制其发生范围，因此成为该病害防治的重要基础。

在松材线虫的检测鉴定方法研究方面，从传统的形态学鉴定到现代的分子检测技术均有不少研究。但这些方法或者需要专业人员的经验技术，或者需要复杂的仪器设备。此外，检测方法复杂、灵敏度一般，以及耗时长等一系列缺陷也阻碍了一些检测手段的大范围推广。

近来研究人员已经开始使用CRISPR来进行核酸体外诊断。基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK，利用LwaCas13a的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速和高灵敏的检测。随着对CRISPR/Cas系统研究的深入，已有多种CRISPR/Cas系统被开发成快速、高灵敏的核酸检测工具，并且由于其高度的灵活性、高度敏感性和特异性，正在快速的发展。随着检测技术的不断发展，利用CRISPR-Cas13a检测方法的优越性也逐渐凸显出来。CRISPR-Cas13a检测平台开发成为了病原菌分子检测的一种新的策略。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于此，有必要针对松材线虫的检测问题，提供一种用于检测松材线虫的crRNA及试剂盒。

本发明的目的之一在于提供一种用于检测松材线虫的crRNA，其包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1~2中的至少一种，其能够杂交至靶RNA序列，和b) 与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测松材线虫的试剂盒，其包含所述的crRNA或可转录为所述crRNA的DNA。

本发明利用CRISPR/Cas技术实现松材线虫核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到2.81 copies/μL，说明本发明方法敏感性较好。

附图说明

图1为本发明一实施例的crRNA的筛选结果图，其中，1表示crRNA-1，2表示crRNA-2，3表示crRNA-3，N表示negative control；

图2为本发明一实施例的特异性检测结果图，其中，Bx表示Bursaphelenchusxylophilus (松材线虫)，Bm表示Bursaphelenchusmucronatus (拟松材线虫)，N表示negative control；

图3为本发明一实施例的敏感性检测结果图，其中，1-7为涵盖2.81×10⁸copies/μL至2.81×10²copies/μL浓度的检测，N为negative control。

具体实施方式